技术资源

  • 基因编辑小鼠模型的敲除/表达检测

    由于基因表达和调控的复杂性和多样性,客户获得小鼠模型后,在大量扩繁前,应先对模型中目的基因的敲除/表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。

    检测结果确认后,再进行大量的扩繁及表型实验等。


  • 各类型基因编辑小鼠模型的繁育路线

    CRISPR-Cas9技术获得的阳性F0小鼠繁育需注意:

    ① 利用 CRISPR-Cas9 系统打靶得到的小鼠受 gRNA 的切割效率的影响和 donor 重组效率的影响在 F0 代可能出现多种基因型并存的状态。

    ② 阳性 F0 代小鼠和野生型背景鼠回交后,所得到的后代基因型将会单一。

    ③ F0 代小鼠之间原则上不能相互交配。

    ④ F0代鼠还未建系成功,通常不用F0代鼠进行保种。

    各类模型小鼠的繁育路线如下:

    1)Cas9-CKO小鼠模型的繁育路线

    2)Cas9-KO小鼠模型的繁育路线

    Cas9-KO 类型的阳性 F1 代小鼠需要根据删除片段的大小分别保种建系(line),不同的 line 之间原则上不允许交配。来自同一 line 的 F1 代杂合子小鼠可以相互交配,后代理论上有 25%的概率得到纯合子。

    3)Cas9-KI/PM小鼠模型的繁育路线

    4)转基因小鼠模型的繁育路线


    转基因模型需选择多只首建鼠用于繁育建系,以提高转基因小鼠建系筛选成功的概率。每只首建鼠分别与背景鼠交配建系,首建鼠与首建鼠不能相互交配。繁育建系示意图和具体步骤如下:





  • BAC转基因的优势和适用范围是什么?

    BAC(Bacterial Artificial Chromsomes,细菌人工染色体)转基因技术的优点是,携带的基因组片段大小为100-200kb,可以保留完整的基因及基因的调控区域,可以更加真实的模拟体内基因的表达情况。

    在以下情况下可选择该技术方案:

    ① 无法设计原位敲入方案

    ② 基因的调控区域未知

    ③ 无法确认启动子的组织特异性或者细胞特异性,或无可用的启动子

    ④ 需要表达基因很长,需表达基因的多个转录本或是全部家族基因时

    ⑤ 可与KO配合使用,实现基因的人源化/其他动物源化(通过引入BAC上的调控序列模拟来源动物目的基因的表达调控)


  • 转基因小鼠的优缺点及注意事项?

    对于普通的转基因,表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子,如CAG、EF1α、CMV等将得到全身表达的转基因小鼠;如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子,将得到组织特异性表达的转基因小鼠,如在AP2的promoter启动下进行表达,会得到脂肪组织特异表达的转基因小鼠。需要特别说明的是,转基因的策略是将转基因片段直接注射到小鼠的受精卵中,转基因片段将会在小鼠基因组中进行随机插入,因为是完全随机的,有可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达,也有可能插入到一些增强区导致转入的基因高表达,通常会出现在小鼠基因组中多拷贝插入的现象。通过原核注射的方法得到的第 一代转基因小鼠称为 founder(首建鼠),由于上述随机性,每一只founder都是不一样的,以每一只founder起源构建得到的可稳定遗传的品系称为line,不同的line之间的表达由于实际插入位点的不同和/或插入拷贝数的不同会有差异。首建鼠与首建鼠之间不应该相互交配。

  • 模型构建中可能发生的异常情况有哪些?

    若目标基因是生殖发育相关的重要基因,则全身敲除该基因后可能会导致阳性鼠死亡或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用条件性敲除的设计方案。

    如果基因有过表达致死或影响生殖的情况,则过表达模型(转基因或者安全位点敲入等)可能会发生表型,导致无法获得阳性小鼠,或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用诱导表达的设计方案。

    显性负效突变(Dominant negative mutation)类模型,杂合子小鼠便会出现表型,如果表型严重到影响到鼠生殖和发育的,可能无法获得阳性小鼠,或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用诱导表达突变的设计方案。


  • Tet-On/Tet-Off和CreER/loxP诱导系统区别


    Tet-On/Tet-Off系统

    loxP/CreERT2系统

    Tet-On/Tet-Off和loxP/Cre系统联用

    优点

    基因的表达/关闭是可逆的;

    从时间和空间上特异性调控基因的表达/关闭

    基因的表达和关闭不可逆;

    从时间和空间上特异性调控基因的表达

    通过tetO-Cre来诱导目的基因的表达和关闭,不可逆;

    从时间和空间上特异性调控基因的表达

    缺点

    Dox可能存在毒副作用;

    可能存在泄露;

    目标基因非内源启动子调控

    他莫昔芬可能存在毒副作用;

    可能存在泄露

    需要三种鼠配在一起使用(rtTA / tTA 小鼠,tetO-Cre小鼠,目的基因小鼠);

    可能存在泄露

    应用

    目的基因诱导表达/关闭

    目的基因诱导敲除,诱导表达或诱导突变

    目的基因诱导敲除,诱导表达或诱导突变



  • CRISPR/Cas9技术具有的优势是什么?

    1)基因组多位点打靶。可以同时对靶基因上的多个位点实行剪切及打靶,实现基因组改造的目的。

    2)使用更方便,费用更低。无论是ZFN 还是TALEN都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列,这些识别序列的合成或组装耗时耗力且费用很高。CRISPR/Cas系统只需改变很短的RNA序列就可以实现不同位点的特异性识别,CRISPR/Cas系统只需转录/合成一次Cas核酸酶就可完成多次实验,极大地降低了成本。

    3)无物种限制。

    4)打靶效率高。利用Cas9蛋白进行切割后,机体在修复DSB时如果提供模板,则同源重组效率较无DSB修复时的几率高近100倍;同时相比于传统基因打靶需要较长同源臂(3K-5Kbp)的情况,利用Cas9技术,所需同源臂的长度大大减小(<1Kbp)。


  • 敲入模型片段插入在基因的N端还是C端?

    插入在N端还是C端要结合蛋白的结构域和蛋白的定位情况来综合考虑。插入位置尽量要避开蛋白重要的结构域,如果N端有分泌信号肽,可选择插入在基因的C端,但若实在需要插入在N端,可插入到信号肽的后面,但需要考虑插入外源序列后对信号肽切割效率的影响,此时可用 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 或类似的信号肽预测软件进行事先预测评估。

  • 设计模型时是否添加标签的考量是什么?

    我们在设计转基因或敲入小鼠模型的时候,如果表达的目标基因跟小鼠内源基因相同,或目前市面上没有较好的抗体来检测目的蛋白的表达时,可在设计载体时加入Tag。有多种标签可选择用于标记目的蛋白,常用的小标签有HA、Flag、Myc、His等,可用于蛋白检测、免疫沉淀等生化应用;常用的荧光蛋白有GFP、RFP、mCherry 、tdTomato等,可用于蛋白定位(包括亚细胞定位)和活细胞成像等(需要注意,通过2A肽段编码序列或IRES间隔的荧光蛋白不与目的基因表达产物形成融合蛋白,因此不能起到标签的效果,不能反应蛋白的亚细胞定位或作为标签使用,仅能标示目的基因的时序性和组织特异性表达)。需要注意的是,Tag加入后可能会对基因的表达或蛋白的功能产生无法预期的影响,一般来说蛋白标签分子越大,影响可能会越大。

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