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核酸提取与质量控制
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PCR体系构建
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PCR程序说明
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凝胶电泳
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鉴定服务与寄送标准
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常见问题及解决方案
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1、PCR假阴性(扩增条带弱或无条带)
A 特征
● 样品目的条带无法扩增或条带弱;
● 阳性对照同样没有条带或条带极弱;
B 原因
● 目的片段条带过大导致扩增效率低;
● 未完全重复我方扩增体系(酶、DNA提取、程序等);
● PCR仪温控模块差异;
C 解决方式
● 设计备用引物,尽量缩短PCR产物大小;
● 完全按照我们的体系来进行鉴定;
● 由于仪器、操作等环节依然存在变量,若上述处理无法改善,建议梯度测试最优退火温度。
2、PCR假阴性(泳道弥散状、伴随核酸挂孔现象)
A 特征
● 胶孔大量发光,DNA无法脱离胶孔;
● 泳道出现弥散状抹带,通常伴随挂孔现象;
B 原因
● DNA通过碱裂解、一步法试剂盒提取,未经纯化使用,蛋白裹在核酸上,导致核酸无法跑出胶孔;
● DNA模板附着较多杂质,影响引物的退火结合;
● 弥散的泳道通常为一些降解的核酸片段;
C 解决方式
● 稀释DNA模板,降低杂质比例;
● 重新纯化提取DNA模板(乙醇纯化、离心柱纯化等);
● 及时电泳,避免扩增产物长时间存放室温或4℃冰箱。
3、PCR假阳性(出现污染)
A 特征
● 阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带,通常会稍弱于阳性样品的主带,偶有与主带完全相同的亮度;
● 常发生于PCR产物小于500bp的反应中,产物越小,污染可能性越高;
B 原因
● 样品交叉污染,包括DNA模板、扩增体系配置或者电泳时污染;
● 气溶胶污染,少量样品鉴定时偶发,大批量样品鉴定、或者长时间使用同一对引物鉴定时发生频率明显增高;
C 解决方式
● 轻微污染时,提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行;
● 污染严重时,重新设计备用引物检测,条带不小于500bp,同时使用上述调整体系。
4、PCR特异性差(存在非特异性条带)
A 特征
● 除目的条带外,存在其他特异性扩增的产物,有时非特异性产物与目的带接近,影响结果判定;
B 原因
● 引物不特异;
● 酶的效率太强、退火温度偏低、退火延伸时间过长;
C 解决方式
● 非特异性扩增条带较弱时,提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行,可有效抑制非特异性扩增;
● 非特异性扩增条带较强时(杂带亮度与目的带几乎一样或者更亮),重新设计PCR引物。
5、PCR优势扩增
A 特征
● PCR发生优势扩增,两条带的亮度不同,甚至可能有一条带完全无法扩增;
B 原因
● 当一个PCR反应中存在超过一种产物时,不同的产物会存在竞争性扩增,导致其中一种产物的产量远大于其他产物;
● 通常小条带比大条带更容易扩增,且两条带差距越大,优势扩增现象越明显;
● 个别情况下,比如产物序列存在特殊结构,也会出现大条带优势扩增现象;
C 解决方式
● 集萃药康鉴定方案为避免优势扩增干扰,通常两条带差距超过300bp,会分别设计引物用于验证,避免优势扩增出现。
6、电泳条带弯曲
A 特征
● 电泳结果出现“笑脸状条带”;
B 原因
● 制备琼脂糖凝胶时,煮沸后部分水分蒸发,导致琼脂糖凝胶中的电泳液浓度,高于电泳槽中的电泳液浓度。此时胶孔中的PCR产物,中心区域迁移速率快,周围靠近电泳液的产物迁移速率慢,展现出严重的弯曲;
C 解决方式
● 煮沸凝胶后,需要添加蒸馏水,补足蒸发的体积,需要注意缓慢添加,并同时均匀晃动,避免局部降温过快,导致凝胶冷却不均匀产生结块。
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产品及服务条款
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产品及服务条款
欢迎阅读江苏集萃药康生物科技股份有限公司(“集萃药康”)产品及服务条款协议(下称“本协议”)。本协议阐述之条款和条件适用于您与集萃药康及其关联方之间就集萃药康提供的产品或服务内容的通用条件进行约定:
一、集萃药康允诺的保证,及明确的责任承担范围
集萃药康使用和建立了符合国际AAALAC标准的SPF级动物设施和标准化实验动物质量管控体系。
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二、您在使用集萃药康提供的产品的过程中应当注意:
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(1)不得通过繁育、克隆等方式繁衍集萃药康的实验动物;
(2)不得自行或通过第三方将产品或其衍生产物通过售卖、赠与等方式直接或间接转让或委托给第三方;
(3)未经集萃药康书面授权,不得对产品或其衍生产物进行基因改造;
(4)其他任何违反伦理、触犯动物福利性规定或损害集萃药康利益的行为;
(5)未经集萃药康许书面明确同意,不得将相应产品用于商业用途。“商业用途”包括但不限于提供合同技术服务、筛选化合物或抗体、制备或生产产品用于销售、开展以营利为目的的研究活动、将产品或其衍生产物提供给营利性机构。
此外适用于某些模型、产品和服务的特殊条款和条件将于集萃药康官网、策略图、订单、协议或其他文件中另行规定。
Ø 明确来源
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三、集萃药康产品和服务的知识产权归属
用于提供产品或履行服务产生的任何发明、技术和知识产权等均归属于集萃药康。如集萃药康与您之间形成委托技术服务关系的,服务成果涉及的知识产权由双方另行约定。除非双方之间有明确的书面合同约定,否则任何一方均不得凭借合作而取得另一方拥有的专利、商业秘密、商标或任何其他知识产权的所有权。
四、衍生产物的定义
衍生产物 包含但不限于如下:
(1) 从产品获得的并脱离该产品本身的遗传物质、细胞、组织、器官等物质。
(2) 动物产品的后裔,即亲代中至少一方为该动物产品,交配、杂交所获得的子代。
(3) 从动物类产品的后裔获得的并脱离该后裔本身的细胞、组织、器官、遗传物质等物质。
(4) 产品经基因修饰、转基因等基因改造后的产物。
(5) 由上述(1)-(4)中的物质、后裔、产物所直接或间接产生的,或作为中间产物产生的遗传物质、细胞、组织、器官、动物等产物。
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基因编辑小鼠模型的敲除/表达检测
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由于基因表达和调控的复杂性和多样性,客户获得小鼠模型后,在大量扩繁前,应先对模型中目的基因的敲除/表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。
检测结果确认后,再进行大量的扩繁及表型实验等。
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各类型基因编辑小鼠模型的繁育路线
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CRISPR-Cas9技术获得的阳性F0小鼠繁育需注意:
① 利用 CRISPR-Cas9 系统打靶得到的小鼠受 gRNA 的切割效率的影响和 donor 重组效率的影响在 F0 代可能出现多种基因型并存的状态。
② 阳性 F0 代小鼠和野生型背景鼠回交后,所得到的后代基因型将会单一。
③ F0 代小鼠之间原则上不能相互交配。
④ F0代鼠还未建系成功,通常不用F0代鼠进行保种。
各类模型小鼠的繁育路线如下:
1)Cas9-CKO小鼠模型的繁育路线
2)Cas9-KO小鼠模型的繁育路线
Cas9-KO 类型的阳性 F1 代小鼠需要根据删除片段的大小分别保种建系(line),不同的 line 之间原则上不允许交配。来自同一 line 的 F1 代杂合子小鼠可以相互交配,后代理论上有 25%的概率得到纯合子。
3)Cas9-KI/PM小鼠模型的繁育路线
4)转基因小鼠模型的繁育路线
转基因模型需选择多只首建鼠用于繁育建系,以提高转基因小鼠建系筛选成功的概率。每只首建鼠分别与背景鼠交配建系,首建鼠与首建鼠不能相互交配。繁育建系示意图和具体步骤如下:
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