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  • 小鼠基本信息介绍

  • 小鼠常见的生物学特性

    小鼠正常生理学参考值

    小鼠血型抗原分类

    小鼠常见的健康问题

    实验动物使用原则

    近交系、远交系及杂交系小鼠区别

    BALB/c,B6,129品系区别

    常见的实验动物分级

    小鼠品系的命名基本原则

    B6小鼠D0-D14天的肤色和日龄图谱

  • 一、一般特性

    1、外形:

    体型小,发育成熟时体重:雄性20~40g,雌性18~40g;面部尖突,长有19根长长的触须,耳耸立呈半圆形、眼大、鼻尖,尾长与体长约相等。 尾部表皮覆有小角质鳞片。(大约200片鳞片)

    毛色因品系品种而异,常见有:白色、野灰色、黑色、棕色、黄色、巧克力色和肉桂色等。

    2、性情:

    性情温顺,容易捕捉,胆小怕惊,不主动咬人。但性成熟的非同窝雄性易相互打斗并咬伤背部、尾部、生殖器等。

    3、感官:

    很少依赖视觉,对动态物体敏感,能看到紫外线,但无法看到红光。嗅觉灵敏。能听到超声波,雄性小鼠通过超声波吸引雌性小鼠。

    4、易感性:

    对外界环境反应敏感,适应能力差,不耐冷、热, 对疾病抵抗力弱。当强光或噪声刺激可导致哺乳母鼠发生食仔现象。温度过高或过低时生殖能力明显下降,严重时会导致死亡

    5、习性:

    高度群居,通过释放信息素传递信息。

    雄性优势明显,非同窝雄性小鼠间好斗。在群体中处优势者胡须健全,而处劣势者则容易掉毛、掉胡须、易受伤。

    喜暗怕光。

    昼伏夜出,其进食、交配、分娩多发生在夜间。

    小鼠往往通过依靠坚固物体来获得安全感,并通过身体敏感的毛发感知周围物体及压力负荷。

    有筑巢特性,饲育时需提供遮掩物和筑巢材料。


    二、生理学特性

    1、消化生理

    胃容量小(1.0-1.5ml),功能差,不耐饥饿。肠道短, 盲肠不发达,消化功能差。集萃小鼠采取任食的方式饲养。属杂食性动物,但以粮食作物为主,自身能合成维生素C。喜吃淀粉含量高的饲料,以谷物为主,蛋白质含量应达到20%-25%。

    2、体温调节与代谢(正常体温为37~39℃)褐色脂肪组织参与代谢和增加热能。

    小鼠没有汗腺,以体温升高、代谢率下降以及耳血管扩张加快散热。新生小鼠是变温动物, 20天后才具有体温调节能力。通过呼出的气体在鼻腔内冷却以及尿液的高度浓缩来保持水分。

    小鼠排尿量少,一次仅1-2滴。尿液高浓度浓缩,尿中含有蛋白质和肌酸酐。

    当遇到危险时,小鼠通过排尿释放警戒的信息素用于同类间报警。

    3、免疫功能

    小鼠淋巴系统特别发达,外界刺激可使淋巴系统增生,因此易患淋巴系统疾病。

    小鼠无扁桃体,胸腺在性成熟时最大,骨髓为红髓,终生造血。对多种病毒和病原体易感。对致癌物敏感,自发性肿瘤多。

    4、外观判断健康的标准:

    食欲旺盛,眼睛有神,反应敏捷,体毛光滑,肌肉丰满,活动有力,身无伤痕,尾不弯曲,天然孔腔无分泌物,无畸形,粪便黑色呈麦粒状。

    5.、生殖生理

    小鼠性成熟早,一般36-42日龄即性成熟。 一般雌鼠交配后10-12小时,在阴道口可见1个白色、 绿豆大小的阴道栓, 防止精子倒流,以提高受孕率, 可以作为交配的标志。一般雌鼠6周龄配繁,雄鼠8周龄配繁。发育迟缓,体弱的小鼠品系可适当延长一段时间安排配繁。

    小鼠性周期为4-5天,一个性周期可以分为4个阶段。 发情后2-3小时可排卵,根据品系不同一次可排10-23个卵子。

    繁殖能力强,全年均可繁育。有产后发情的特点, 在分娩后24小时内排卵,此时交配即可受孕,俗称“血配”。

    指标

    正常值

    指标

    正常值

    初生体重

    1-1.5g

    日耗料

    2.8-7g

    成年体重

    近交系为17-35g左右

    封闭群为30-55g左右

    日饮水量

    4-7ml

    平均窝产仔数

    10-12

    日排粪量

    1.4-2.8g

    平均寿命

    1-2

    日尿量

    1-2ml

    妊娠期

    19-21 d

    心跳次数

    480-738/min

    哺乳期

    19-21 d

    呼吸次数

    84-230/min

    胃容量

    1-1.5ml

    体温

    37.5-38.8


    小鼠不分血型。小鼠血型抗原分为抗原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,其中抗原Ⅱ只存在于某些品系而不存在于另一些品系小鼠中。抗原Ⅱ是一种组织相容性抗原,将小鼠的组织相容性抗原称为H-2(histocompatibility antigen-2, H-2)。编码H-2抗原的基因定位于小鼠第17号染色体上,是由多基因座组成,故称此基因群为主要组织相容性基因复合体。


    脱毛:小鼠在理毛过程中经常脱毛,通常无害。但打斗、皮肤疾病等引起的脱毛应予以重视,并给予及时、有效的护理。

    打斗:雄鼠性成熟后合笼有时会发生打斗现象。打斗导致的伤口通常发生在尾根、背部、阴茎、肛门,或足部、肩部。打斗导致的伤口常常伴随流血和结痂。在笼具中放置玩具等可吸引小鼠的注意力,避免打斗现象。打斗现象严重时,应对受伤小鼠给予相应的抗生素治疗,并将攻击性强的小鼠(通常没有伤口)移出。某些品系的小鼠,如FVB、BALB/c、SJL攻击性较强。

    牙齿咬合不正:当小鼠体重增长明显慢于其它同窝出生的小鼠时,应检查该小鼠的门牙是否咬合不正,包括上下门牙是否咬合、下门牙是否过长、上门牙是否弯曲向内生长。对此类小鼠,可用消毒后的剪刀对其门牙定期进行修剪。除为动物模型可能的表型外,偶发性的牙齿咬合不正的小鼠应及时对其实施安乐死。

    肿瘤/肿块:肿瘤或肿块可在小鼠身体的任何部分发生。应定期观察小鼠的体态是否平滑、对称。自发性的或外源接种的肿瘤或肿块,其尺寸超过小鼠身体的10%(~1cm直径),或出现溃烂时,将影响小鼠的饮食、行动等行为,并影响小鼠的身体状况。在此类情况下,建议应及时对其实施安乐死。

    皮肤溃烂:小鼠皮肤溃烂可能由多种因素引起,包括打斗、抓挠耳标、寄生虫等。当小鼠的皮肤溃烂持续难愈,或皮肤溃烂超过体表面积的10-20%时,应及时对其实施安乐死。

    直肠(肛门)脱落:在一些品系的小鼠中常见直肠(肛门)脱落,其原因不明。通常对此类小鼠应定期(每月)观察。当直肠(肛门)脱落部分过大、出现坏死或小鼠健康状况明显下降时,应及时对其实施安乐死。

    子宫脱落:小鼠生产后,有时会出现子宫脱落现象。应注意区分子宫脱落与直肠(肛门)脱落。子宫脱落通常导致小鼠的极度不适,应及时对其实施安乐死。

    小鼠行为:每次打开笼具时,应观察小鼠的行为,特别应注意比较同笼饲养的小鼠之间行为。包括小鼠是否活跃,是否表现出迟钝或昏睡;或表现出明显的不适;小鼠是否表现出弓背或呼吸困难;是否表现出过度的抓挠等现象。出现上述现象,应对小鼠做进一步细致的观察和检查。

    贫血:应定期检查小鼠是否患贫血。检查小鼠足底的颜色是检查小鼠是否贫血快速、有效的方法。如小鼠足底呈现苍白或无血色,应进一步检查小鼠是否患有贫血症,并相应补充营养。

    脱水:脱水的小鼠通常表现出以下特征:眼睛凹陷,面部毛发杂乱,触碰后毛发不能很快恢复正常状态。皮下注射电解质后,一部分脱水小鼠可能会恢复,但大部分情况下,小鼠的状态会进一步恶化,最终导致死亡。因此建议应及时对其实施安乐死。如脱水小鼠的体温过低(触碰有冷的感觉),这些小鼠的健康状况尤其恶劣,应及时对其实施安乐死。

    腹泻:腹泻小鼠通常不伴随流质样的粪便,其粪便通常较为湿润。判断小鼠是否腹泻的简单、易行的方法是观察笼具:垫料是否与粪便粘附在一起,或粘附于笼具壁上。同时应观察小鼠肛门附近毛发是否被粪便染色,或粘着粪便。小鼠腹泻通常由传染性病原体引起,应由兽医给予相关治疗。腹泻的小鼠应注意观察是否存在脱水现象和/或体重的明显变化。

    体温过低:当小鼠体温过低(低于36.5C或触碰有冷的感觉)时,应引起重视。严重情况下,小鼠会表现出行动迟缓甚至丧失知觉。如不能对其提供保温措施,应及时对其实施安乐死。

    黄疸:小鼠出现黄疸(或皮肤发黄)通常是由于肝脏和/或胆囊功能的异常,或红细胞的不正常破坏引起的。耳朵因毛发覆盖较少,是观察小鼠黄疸较理想的位点。

    尿道/阴道分泌物:病原体感染或泌尿系统/生殖系统肿瘤可能会导致白色或带血不正常尿道/阴道分泌物,应请兽医关注,并予以相关治疗。

    呼吸异常:如小鼠存在呼吸困难、呼吸急促或啰音,通常提示小鼠存在较大健康问题,应及时对其实施安乐死。

    行动异常:小鼠的运动性共济失调、转圈或无力通常是严重疾病的前兆或表征。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

    眼部疾病:小鼠眼睛浑浊、瞳孔的异常放大或缩小、眼球的外凸或内陷常常是严重疾病的前兆或表征,特别当小鼠有其它异常健康状况表征时,应引起充分重视。角膜的发炎、溃烂,经治疗后无明显好转,应及时对其实施安乐死。

    头部偏斜:小鼠的头部偏斜(头部持续偏向一侧)由多种可能的因素引起(如耳朵发炎等),应密切关注小鼠健康状况。头部偏斜严重时,小鼠将不能站立、行走、饮食、饮水。在此情况下,应及时对其实施安乐死。

    异常活跃:小鼠行为的异常活跃由多种可能的因素引起,应密切观察。小鼠行为的异常活跃有时可能暗示神经系统的异常。

    行动迟缓:如小鼠表现出行动迟缓、昏迷、弓背等症状,通常提示小鼠存在较大健康问题,应及时对其实施相应护理或实施安乐死。

    麻痹/瘫痪:如小鼠表现出虚弱、无力支撑其体重,但仍可移动其四肢,应密切关注小鼠健康状况。小鼠的麻痹可能最终导致其瘫痪。多种因素可能导致小鼠失去运动能力而瘫痪。一部分小鼠可能可以从瘫痪中恢复(如脑脊髓炎模型等),在此情况下,应对小鼠提供特别护理,如保温、更易获得食物、饮水等。小鼠通常不能由病理因素(如癌细胞侵入脊髓)引起的瘫痪中恢复,应及时对其实施安乐死。瘫痪小鼠如存在极度丧失体重、褥疮或自残行为,应及时对其实施安乐死。

    毛发散乱:如小鼠毛发散乱,通常是疾病的前兆或表征。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

    颤抖:频繁、严重的颤抖通常是疾病的前兆。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

    实验动物的使用必须遵循“3R”原则,即尽可能使用其它的替代实验手段(Replacement),使用实验动物的数量尽可能地保持最小(Reduction),尽可能用最优化的实验条件开展研究工作(Refinement)。

    除了这“3R”原则外,研究人员应最大限度地保证实验动物免受不必要的不适和疼痛。研究人员(不仅仅是实验动物平台工作人员)有义务密切关注实验动物的健康状况,保证实验动物舒适的生活环境,并对实验动物进行及时的护理和治疗。这是所有研究人员必须遵循的第四个“R”原则,即责任(Responsibility)。同时,精心护理的实验动物将在最大程度上有利于科研工作的开展,包括:更加准确地掌握实验动物的表型,更加明确、准确的实验指标,减小实验误差,及时发现预期之外的表型,并可以使用更少的实验动物获得理想的实验结果,节省科研经费。实验动物安乐死时机的选择

    如实验动物在实验过程中预期将可能遇到任何的不适,在实验动物研究方案中研究人员应明确对实验动物实施安乐死的时机选择原则。正确选择对实验动物实施安乐死的时机不仅将在最大程度上减少实验动物承受的不必要的痛苦,同时有利于研究人员获得更好的实验结果,减少科研经费的浪费。在实验动物安乐死时机的选择中,应明确描述实验动物的健康状况,避免使用含糊、笼统、不明确的表述,如“不适”、“垂死等。


    近交系:经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成,品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。近交系个体99%的基因位点是纯合,个体间差异几乎为零。

    远交系:来自随机交配亲本、个体间遗传背景各异的小鼠。

    杂交系:指两个不同近交系之间进行有计划的交配,杂交所产生的第一代动物,具有两亲本遗传特性或产生新的遗传特性的动物。封闭群动物(Closed colony animals)是指引种于某亲本或同源亲本的动物,让其不以近交形式,也不与群外动物杂交而繁衍的动物群,目的是要求整个群体尽量防止近亲交配而保持着遗传变异,也就是说既保持群体的一般特性,又保持动物的杂合性。


    C57BL/6(B6)小鼠:是近交系,保证遗传背景上的高度稳定性和实验数据的一致性,作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系,用作转基因鼠以模拟人类的基因缺陷类疾病。

    BALB/c小鼠:也是一个近交系,广泛用于免疫学、生理学的动物实验。BALB/c对致癌物极其敏感,常用于肺癌、肾癌等实验动物模型的建立。

    129小鼠:其品系的亚系特别多,遗传背景差异大,但是它的ES培养比较容易,因此ES打靶方法构建的突变体背景是129,构成的突变体会回交到C57BL/6。129不适合作神经学、免疫学等方面的研究。


    清洁级实验动物:清洁级动物在微生物控制方面,除要求必须不带有人兽共患病原和烈性传染病病原及常见传染病病原之外,还要求排除对科学实验研究干扰大的病原体的动物。

    SPF级实验动物:无特定病原体(Specific pathogen Free,  SPF)动物是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物,但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。一般指无传染病的健康动物,空气洁净度要求一万级,是目前国外使用最广泛的实验动物,它的来源,既可来自无菌动物繁育的后裔,亦可经剖胎取后,在隔离屏障设施的环境中,由SPF亲代动物抚育。它不带有对人或动物本身致病的微生物,但不能排除可经胎盘屏障垂直传播的微生物。

    无菌级(germ free)实验动物:所谓无菌动物,就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。从微生物学的观点看,通常实验动物的体内和体外带有寄生虫,体内还常带有细菌和病毒,而且还都难于排除某些潜在的传染病。此外,普通实验动物的血清中含有抗体。所以用并存普通动物进行医学科学研究,将会存在各种各样的干扰,实验结果往往不确切。使用无菌动物作实验就可以克服普通实验所存在缺点,使实验结果正确可靠。


    遗传修饰动物的命名:

    1、 转基因大小鼠

    命名:一个转基因品系名称符号由以下五部分组成,均以罗马字体表示:

    格式:背景品系-Tg(基因名称)##/实验室代码,##表示实验室或机构指定序号。

    例:C57BL/6JGpt-Tg(CD8)23/Gpt

    C57BL/6JGpt表示受体品系,写品系全称。

    Tg表示转基因

    CD8表示转入基因名称,写在括号内。

    当转入基因为在单独基因时,写该基因的官方符号(Official symbol),如CD8、PDCD1等。

    当转入基因为多基因时,不同基因之间用英文逗号“,”分隔,如APP, PS1、HLA-B*2705, B2M等。

    当转入基因为在特定启动子驱动下的基因片段时,写启动子-基因名称,如Nes-Cre、ACTB-EGFP等。

    当转入基因为两个基因的嵌合序列时,用英文斜杠“/”分隔两个基因,如BCR/ABL等。

    23表示实验室或机构指定序号,通常为Founder鼠的编号,也可为实验室另行指定的特定编号;

    Gpt表示实验室或机构在ILAR注册的实验室代码(如:集萃药康的实验室代码为Gpt)。

    2、 打靶突变大小鼠

    定义:通过ES打靶介导的同源重组获得的突变大小鼠品系。

    命名:由背景品系名、基因名、基因修饰类型、实验室或机构指定序号及实验室代码组成,品系名和基因名称以连字符分开,实验室代码前面加/进行间隔。

    格式:背景品系-基因名称基因修饰类型##/实验室代码,##表示实验室或机构指定序号。

    例如:C57BL/6JGpt-Ctnnb1tm1/Gpt

    3、 核酸内切酶介导的突变大小鼠

    定义:通过Talen、CRISPR/Cas9编辑技术获得的突变大小鼠品系。

    命名:由背景品系名、基因名、基因修饰类型、实验室或机构指定序号及实验室代码组成,品系名和基因名称以连字符分开,实验室代码前面加/进行间隔。

    格式:背景品系-基因名称基因修饰类型##/实验室代码,##表示实验室或机构指定序号。

    例如:NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52/Gpt

    NOD/ShiLtJGpt表示背景品系;

    Prkdc表示靶基因,写基因官方符号(Official symbol),斜体。

    em是endonuclease-mediated mutation的缩写,表示该品系为核酸内切酶介导的突变品系,大写C代表CRISPR/Cas9方法制作,大写T代表Talen方法制作;em后面的符号代表基因编辑类型:d代表deletion,in代表insert,d或in后面的数字代表删除或者敲入片段的大小,斜体。

    em后面的数字代表实验室或机构指定序号,通常为founder鼠的编号,也可为实验室另行指定的特定编号, 斜体。

    对于未确定具体突变信息,仅有表型特征的突变,可使用表型名称命名,如Prkdcscid、Apcmin等,斜体。

    对于已经确定具体突变信息的,标明具体突变信息,例如:KrasG12C、SOD1G93A等。

    Gpt表示实验室或机构在ILAR注册的实验室代码(如:集萃药康的实验室代码为Gpt)。

    参考网址:

    集萃药康微信公众号20200416推文(作为有身份的小鼠,认识我从我的名字开始)

    http://informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene.shtml#tarm

    http://informatics.jax.org/mgihome/nomen/anomalies.shtml

    https://www2.jax.org/nomenclature-tutorial/#

    15940229176962161Ckv.png

  • 常见饲养问题

  • 小鼠出现非病理性脱毛现象的可能原因

  • 随着现代化饲养设施及饲养设备的应用,虽然保障了小鼠免受外来致病因素的侵扰,基本根除了临床上由寄生虫、 细菌或真菌等病原微生物引起的脱毛现象, 但实验中部分小鼠仍有不明原因的脱毛现象 困扰着实验人员,影响实验结果的判断。

    撇开病原微生物的影响,还存在其他原因会造成小鼠的脱毛现象。

    1. 打架

    笼养小鼠的习惯特点和群体内部反应常导致其殴斗、 咬尾和嚼须,同性别同笼饲养的雄性小鼠更易发生殴斗,雄性小鼠常以殴斗的形式来称霸于同笼其它雄性小鼠以巩固自己的统治地位。

    2. 生活习性——理毛

    通常此类的脱毛见不到皮肤的损伤,也没有明显的红肿等炎症现象。国外也曾有报道,小鼠建立群体统治等级制度是通过咬毛和嚼须的形式来实现的。常见于C57BL 和C3H小鼠及其杂交一代小鼠。

    3. 机械性损伤

    小鼠的口鼻脱毛除咬毛嚼须外,还有可能是机械性损伤引起的。小鼠有很强的好奇心,在笼养过程中有些小鼠会将口鼻插入笼盒的通风口,长时间的摩擦可引起机械性损伤。

    4. 消毒液刺激

    实验室在日常的管理中有些会用到季铵盐类的消毒液,应考虑是否在实验过程中错误的使用了季铵类消毒液而产生的直接影响。如在实验中镊子浸入季铵类消毒液中未经冲洗便用其将小鼠从一个笼具转移到另一个笼。该类皮肤病灶可使肩胛部和颈部被毛出现黄斑、 脱毛,患部硬结,进而导致皮肤粗糙。

    5. 其它因素

     遗传因素、营养因素(必须氨基酸缺少、维生素缺乏)、饲养密度过大等都可能会引起小鼠的脱毛现象。

  • 集萃资源介绍

  • 集萃药康明星品系小鼠

    为何要选择国家遗传工程小鼠资源库?

    常见cre工具鼠及表达部位

    集萃荧光蛋白标记小鼠模型

    B6-ZsGreenLSL-DTA品系绿色荧光小鼠介绍

    B6-CAG-loxP-STOP-loxP-Cas9-tdTomato小鼠荧光显微镜是否能观察到红色荧光?

    集萃药康颗粒酶B缺失或者敲除的小鼠品系

  • 品系编号

    品系名称

    方向

    品系编号

    品系名称

    方向

    T002726

    PDCD1(BALB/C

    免疫检查点

     

    T002407

    BKS-DB

    代谢

    T003095

    PDCD1(B6

    T001461

    B6-OB

    T003455

    B6-hPDL1

    T001458

    APOE

    T003826

    B6-hPD1/hCTLA4

    T002040

    DIO

    T004022

    B6-hPD1/hPDL1

    T001464

    LDLR

    T004621

    B6-hPD1/hLAG3

    T001475

    NCG

    免疫缺陷

    T003720

    BALB/c-hPD1/hCTLA4

    D000521

    Nu

    T004622

    BALB/c-hPD1/hLAG3

    T001492

    NOD-Scid

    T004025

    BALB/c-hPD1/hPDL1

    T004753

    B6-Rag1-KO

    T003365

    BALB/c-hTIGIT

    N000235

    NOD/LtJ

    T004795

    BALB/c-hPD1/hTIM3

    T001457

    APC

    自发肿瘤

    T003260

    BALB/c-hPDL1

    T004993

    FVB-MMTV-PyMT

    T003635

    H11-CAG-LSL-Ilf3-EGFP 

    T001550

    BALB/c-hCD3E(TG)

    双特异性抗体


    国家遗传工程小鼠资源库(NRCMM)是集遗传工程小鼠的资源保存与供应、疾病模型创制与开发和实验动物人才培训为一体的国家级科技基础条件服务平台。其核心任务是针对国家生物医药创新和发展的需求,为科研机构及医药产业提供完整的人类重大疾病模型保种、生产、供应、信息咨询和人才培训等服务。

    资源库是国家科技部唯一认证的国家级遗传工程小鼠种子中心。资源库于2006年连续5次获得了AAALAC实验动物国际认证,标志着其实验动物管理制度已达到了国际最高标准。同时资源库领衔启动了中国小鼠基因剔除计划,并成为亚洲小鼠突变和资源联盟的主席单位,2012年,NRCMM作为中国唯一一家单位加入国际小鼠表型分析联盟(IMPC), 致力于建立标准化的小鼠表型分析平台。

    资源库建立了成熟的转基因、基因剔除和ENU化学诱变等基因组改造技术平台,成为亚洲最大的基因剔除技术服务中心。通过科研合作和培训等方式,资源库向国内数百家科研单位、医院及制药企业提供各种小鼠模型,并开展转基因与基因剔除小鼠的表型分析的合作研究,包括肿瘤、代谢、心血管、生物节律和生殖等多个系统。资源库的合作单位几乎囊括了国内所有的优秀科研机构,并与全球最大的几家跨国制药公司,以及美、英、澳、日的多家研究机构建立了良好合作关系。


    Cre工具鼠

    表达部位

    S100a4-2A-CreERT2

    前列腺、前胃、乳腺等组织间质成纤维细胞

    S100a4-Cre(又叫 FSP1-cre

    间质成纤维细胞

    Epcam-CreERT2

    增殖的导管细胞、肿瘤干细胞、小肠、大肠、肝脏、肾脏中均有表达

    Clu-2A-DreERT2

    耳蜗感觉上皮Clu阳性细胞

    Nkx3-1-CreERT2

    在肺部,十二指肠部分和骨骼的椎骨部分

    Hopx-IRES-CreERT2

    肠上皮干细胞、肺部AT1类型细胞等

    Aqp5-iCre

    ATI型细胞,

    Id2-CreERT2

    Cre重组酶活性在发育中的肺的远端尖端肺上皮多能前体细胞,在整个分支形态发生之前,直到胚胎第(E16.5天。

    Scgb1a1-IRES-CreERT2 ( CCSP, CC10, and CCA)

    支气管Clara细胞

    Sftpc-IRES-CreERT2

    Ⅱ型肺泡细胞

    SFTPC-TETO-Cre

    肺脏特异

    Afp-CreERT2

    胚胎发育早期的肝脏

    Alb-Cre

    肝脏实质细胞

    Alb-CreERT2

    肝脏实质细胞

    Alb-DreERT2

    肝实质细胞

    Alb-IRES-iCre

    肝脏实质细胞

    Clec4f-IRES-CreERT2

    肝脏的Kupffer细胞

    Clec4f-IRES-iCre-2A-tdTomato

    肝脏的Kupffer细胞

    Lrat-2A-Cre

    肝星状细胞

    Cyp2e1-CreERT2

    肝脏>肾脏>脂肪细胞

    Ly6a-CreERT2

    造血干细胞,心脏,肾脏

    Pou5f1-CreERT

    胚胎干细胞

    Tert-CreERT2

    胚胎干细胞>胰岛β细胞>MEF细胞

    Acan-IRES-CreERT2

    生长板和关节软骨,半月板、气管和椎间盘的纤维软骨

    BGLAP-Cre(又叫OC-cre

    成骨细胞

    Ctsk-2A-Cre

    破骨细胞

    Ctsk-2A-CreERT2

    破骨细胞

    Twist2-Cre

    在中胚层组织中(例如branch弓和somites)以及在间充质衍生的软骨细胞和成骨细胞中。

    Myf5-Cre

    在骨骼肌和真皮

    Myl1-NLS-iCre

    骨骼肌组织,包括腓肠肌、胫骨前肌和股二头肌

    Axin2-CreERT2

    Wnt/β-catenin通路激活的细胞

    CAG-Cre

    广泛表达

    CAG-CreERT2

    广泛表达

    CAG-Dre

    广泛表达

    CAG-DreERT2

    广泛表达

    Cdkn2a-Luc-tdTomato-CreERT2

    衰老细胞

    EIIa-Cre

    广泛表达

    FLP

    广泛表达

    H11-ddCre

    可诱导的广泛表达

    Notch1-CreERT2

    Notch1阳性细胞,涉及发育、自我更新和恶性的细胞

    Prom1-CreERT2

    胚胎中,枢神经系统,肾,肠和骨骼系统。成人中,在胰腺的腺泡细胞和胰岛细胞、结肠的杯状上皮细胞和柱状上皮细胞、眼睛的光谱、肾小管细胞、大脑、肺以及男性和女性生殖系统中均有表达

    Upk3b-Dre

    在神经嵴细胞和心脏,肝脏,肾脏和肺

    Acta2-Cre

    肌肉成纤维细胞

    Acta2-CreERT2

    肌肉成纤维细胞

    Myf6-CreERT2

    肌肉

    Myh11-cre/ERT2(又叫SMMHC-CreERT2

    平滑肌细胞

    Pax7-IRES-Cre-ERT2

    卫星细胞,成人肌肉干细胞

    Pax7-IRES-iCre

    骨骼肌祖细胞和卫星细胞

    ACTA1-cre(又叫HSA-Cre

    心脏-心肌横纹肌

    Tagln-Cre(又叫SM22a-Cre

    成人平滑肌细胞和心肌细胞

    Grik4-Cre

    海马

    Map2-CreERT2

    神经元

    Mnx1-Cre

    运动神经元

    Mnx1-CreERT2

    运动神经元

    Nes-Cre

    神经元和胶质细胞前体

    Nes-Cre/ERT2

    神经干细胞,神经元/胶质细胞前体

    NG2-CreERT2

    NG2细胞

    Nkx2-1-CreERT2

    基底节和视前区的内侧和尾侧神经节

    Nos1-CreERT2

    小脑、嗅觉、球、海马、皮质、纹状体、基底前脑和脑干

    Nos1-IRES-iCre

    小脑、嗅、球、海马、皮层、纹状体、基底前脑和脑干中的离散神经元群

    Nr5a1-Cre

    下丘脑腹内侧核以及垂体、生殖腺和肾上腺中表达甾体生成因子SF1的神经元

    Ntrk2-CreERT2

    背根神经节神经元

    Nts-IRES-iCre

    在大脑腹侧被盖区和其他地方的神经元

    Olig2-IRES-iCre

    少突胶质细胞系细胞和运动神经元

    Oxt-IRES-iCre

    海马结构内,皮质亚板,纹状体,丘脑,下丘脑和延髓

    P2ry1-Ires-iCre

    肺和脑干迷走神经感觉神经元

    Pdyn-IRES-iCre

    下丘脑室旁区

    Penk-IRES2-iCre

    在嗅区,海马结构,纹状体,苍白球和下丘脑

    Pomc1-Cre

    弓状核(下丘脑)和孤束核(后脑):控制饮食摄入相关脑区

    Prl-IRES-CreERT2

    垂体

    Pvalb-IRES-iCre

    小白蛋白阳性的神经元,如皮层和海马区的散在中间神经元群

    Pvalb-T2A-iCre

    小白蛋白表达的神经元,注:Cre在精子中表达。

    Slc17a6-CreERT2

    兴奋性谷氨酸能神经元细胞

    Slc17a6-IRES-iCre

    兴奋性谷氨酸能神经元细胞

    Slc17a7-IRES2-iCre

    整个皮层,嗅球和前嗅核。在纹状体和海马中可见散在表达,在脑桥、上丘和丘脑前背核的限制性群体中富集

    Slc17a8-IRES2-iCre

    皮层,脑核,丘脑和中脑

    Slc32a1-IRES-iCre

    抑制性γ-氨基丁酸能神经元

    Slc6a11-CreERT2

    星形胶质细胞和神经元

    Slc6a3-Cre(又叫DAT-cre)

    黑质和蓝斑的多巴胺能神经元

    Slc6a3-IRES-iCre

    黑质和蓝斑的多巴胺能神经元

    Slc6a4-Cre

    5-羟色胺能神经元

    Slc6a4-iCre (又叫SERT-Cre)

    血清素转运蛋白阳性的细胞,Cre重组酶活性针对血清素能神经元。 在成年小鼠中,主要在产生5-羟色胺的大脑神经(脂核)和肠道(肠嗜铬细胞)的神经元中观察到Cre重组酶的活性。 在发育过程中,在丘脑,扣带回皮层和海马CA3区锥体细胞,以及在大脑的多个非血清素神经元和神经c衍生物中观察到Cre重组酶活性。

    Sox2-2A-DreERT2

    在囊胚、神经前体细胞和许多成体上皮组织中

    Sox2-CreERT2

    在囊胚、神经前体细胞和许多成人上皮组织中

    Sst-IRES-Cre

    生长抑素表达神经元

    Tac1-IRES2-iCre

    在副嗅球和前嗅核、丘脑、VMH和中脑结构(如上丘)以及尾状、中隔、下丘脑、中脑、后脑和小脑的散在细胞中

    Th-cre

    多巴胺能神经元

    Th-IRES-creER

    多巴胺能神经元

    Tlx3-Cre

    背根神经节

    Tph2-iCre/ERT2

    中缝核中Tph2表达的神经元

    Trpm2-T2A-iCre

    TRPM2表达神经元

    Trpm8-2A-Cre

    TRPM8表达的感觉神经元

    Trpv1-Myc-IRES-Cre

    在背根神经节和外周感觉神经末梢,也在中枢神经系统和非神经热调节组织中

    Vip-IRES-iCre

    下丘脑弓状核、外侧膝状体背侧核、丘脑腹侧核和终纹床核,散在上丘和整个皮层中表达

    Wnt1-Cre

    发育中的神经嵴和中脑

    Esr1-2A-iCre

    神经分化,交感神经系统发育,下丘脑,女性生殖器官(子宫内膜和卵巢基质细胞)和男性输出管上皮细胞

    Cx3cr1-CreERT2

    单核细胞、树突细胞、NK细胞、脑小神经胶质细胞

    Amh-Cre

    睾丸支持细胞

    Amhr2-Cre

    睾丸前颗粒细胞、颗粒细胞和雌性生殖道 

    Amhr2-Cre

    睾丸颗粒细胞前体、颗粒细胞和雌性生殖道 

    Aqp2-Cre

    肾细胞集合管和睾丸精子

    Ddx4-cre/Vasa-Cre

    雄性和雌性胚胎生殖细胞,可用于全身性敲除

    Dppa3-Cre

    胚胎干细胞、胚胎早期、生殖细胞系早期

    Lcn5-Cre

    雄性生殖特异Cre

    Ltf-iCre-IRES-tdTomato

    子宫上皮

    Pbsn-Cre

    前列腺上皮细胞

    Pgk2-cre

    精母细胞和精细胞

    Pgr-iCre

    孕激素响应的细胞/组织,例如子宫,卵巢,输卵管,垂体和乳腺。 它们也可能用于研究下丘脑和类固醇激素诱发的恶性肿瘤中的性二形核。

    Pgr-IRES-Cre

    孕酮反应细胞/组织,如子宫、卵巢、输卵管、垂体和乳腺

    Prm-cre

    雄性生殖细胞

    Vsx2-Cre

    视网膜

    Bmi1-IRES-CreER

    位于小肠隐窝底部附近的离散细胞(主要位于隐窝底部以上的四个细胞)

    Lgr5-2A-DreERT2

    表达Lgr5的小肠干细胞

    Lgr5-EGFP-IRES-creERT2

    表达Lgr5的小肠干细胞

    Villin-Cre

    小肠绒毛和隐窝上皮细胞

    Aplnr-CreXER2

    SV(心脏静脉极的短暂发育结构)和许多的心脏发育中的冠状血管中,主要在背侧和外侧

    Cdh5-cre(又叫VE-Cadherin-Cre

    发育和静止血管的胚胎和成体内皮细胞

    Ckmm-Cre

    骨骼肌和心肌细胞

    Hey2-CreERT2

    在胚胎发育过程中的心室紧凑型心肌、心室间隔、房室管的心内膜细胞(AVC),流出道(OFT)和小梁底部表达, 以及前心外膜细胞和心外膜细胞。

    Isl1-CreERT2

    心脏--心脏祖细胞

    Kit-CreERT2

    表达Kit基因的心肌细胞前体

    Ly6a-2A-iCre

    Ly6a表达细胞,包括心脏血管内皮细胞

    Myh6-Cre

    心脏--心肌细胞

    Myh6-Cre/Esr1

    心脏-心肌细胞

    Nkx2.5-IRES-Cre

    心脏新月体和心脏管前体细胞

    Tek-Cre(也叫Tie2-cre

    血管内皮细胞

    Tek-cre/ERT2(也叫Tie2-cre/ERT2

    血管内皮细胞

    Tie1-2A-Cre

    血管内皮细胞

    Tnni3-CreERT2-Rox-tdTomato

    心脏--心肌细胞

    Tnnt2-CreERT2-Rox-tdTomato

    心脏--心肌细胞

    Isl1-Dre

    心脏和后肢祖细胞

    Isl1-iCre

    心脏和后肢祖细胞

    Gp1ba-T2A-iCre

    血小板,巨核细胞谱系来源细胞

    Pf4-Cre

    巨核细胞谱系来源细胞,以及中枢神经系统的边缘区巨噬细胞

    Ctnnal1-2A-Cre

    造血干细胞

    Fgd5-mNeonGreen-2A-CreERT2

    造血干细胞和内皮细胞

    Vav1-icre(又叫Vav-iCre

    造血细胞和造血干细胞

    Cdh6-CreERT2

    视网膜神经节细胞

    Kcng4-iCre

    双极细胞5型,以及α-视网膜神经节细胞亚群

    Neto1-iCre

    双极细胞2型,以及一些无长突细胞和视网膜神经节细胞

    Ins2-Cre/ERT

    胰腺β细胞

    Bhlha15-CreERT2 (Mist1CreERT2)

    胰腺腺泡细胞

    Gcg-Cre

    胰腺α细胞

    Gcg-Cre/ERT2

    胰腺α细胞

    Ins1-creERT(又叫MIP-Cre/ERT

    胰腺β细胞

    Ins1-CreERT2

    胰腺胰岛素β细胞

    Ins2-Cre

    胰腺β细胞

    Pdx1-Avi-CreERT2

    胰腺细胞

    Pdx1-Cre

    胰腺

    Ptf1a-CreERT2

    胰腺细胞(胚胎发育到9.5天开始表达)

    Adipoq-CreERT2

    脂肪细胞

    Fabp4-2A-DreERT2

    在棕色和白色脂肪组织中

    Fabp4-Cre

    棕色和白色脂肪组织

    Ucp1-Cre

    棕色脂肪

    Ucp1-CreERT2

    棕色脂肪

    Foxp3-tdTomato-2A-CreERT2

    调节性T细胞 (Treg cells)

    Foxp3-tdTomato-2A-iCre

    调节性T细胞 (Treg cells)

    Cdh5-2A-CreERT2

    血管内皮细胞

    Piezo1-CreERT2

    血管发育中的内皮细胞

    Gli1-CreERT2

    表达Gli1的细胞,可用于研究Hedgehog 信号通路响应的细胞

    Meox2-Cre

    在胚胎第5天的外胚层组织

    Shh-CreERT2

    胚胎期小鼠肢体发育的Shh阳性细胞中

    Gja1-2A-DreERT2

    表皮的基底层和棘层

    KRT14-Cre

    皮肤、牙齿上皮和口腔外胚层可检测到Cre活性

    Tyr-CreERT2

    胚胎黑素母细胞、毛囊球黑素细胞、真皮树突状胚胎、尾皮表皮黑素细胞和眼脉络膜细胞

    Nkx3-1-IRES-CreERT2

    前列腺

    Nkx3-1-IRES-iCre

    前列腺

    Wap-IRES-Cre

    乳腺分泌性上皮细胞

    MMTV-Cre

    在原始和泌乳的乳腺,唾液腺,精囊,皮肤,红细胞,B细胞和T细胞中检测到高水平的Cre活性。

    Col2a1-2A-CreERT2

    在软骨细胞中(胚胎发生和出生后),以及其他通常表达内源性II型胶原基因的细胞

    Cyp1a1-Cre

    上皮细胞;肝实质、外分泌胰腺、小肠、食管上皮、胆囊上皮等

    Foxj1-GFP-CreERT2

    有运动性纤毛的上皮细胞,如肺、输卵管,室管膜和睾丸以及活动性纤毛的各种细胞

    Krt14-CreERT2

    表皮分裂细胞及其他分层鳞状上皮

    Krt19-CreERT2

    多个内胚层器官中的上皮细胞,

    Krt5-2A-CreERT2

    基底上皮细胞、气道上皮细胞

    KRT5-CreERT2

    上皮基底层细胞,如皮肤,气管等

    Krt5-IRES-CreERT2

    基底上皮细胞,如皮肤,气道上皮等

    Agrp-CRE

    神经系统,agouti相关蛋白表达神经元,下丘脑GABA神经传递

    Arc-CreERT2

    Arc表达细胞/组织;包括由特定体感、视觉和听觉刺激激活的神经元

    Ascl1-Cre

    表达Ascl1的神经前体细胞

    Avp-IRES2-Cre

    加压素表达细胞(下丘脑内)

    Calb1-2A-EGFP-Cre

    海马、纹状体、丘脑、中脑和小脑的calbindin 1表达细胞

    Calb2-IRES-iCre

    大脑和大脑皮层

    Camk2a-Cre

    前脑,包括海马CA1锥体细胞层

    Cartpt-IRES-iCre

    脑组织亚群(包括皮质、脑核、下丘脑和中脑)

    Cck-IRES-iCre

    Cck表达细胞,例如胆囊收缩素阳性神经元

    Chat-IRES-Cre

    胆碱能神经元

    Crh-Cre

    促肾上腺皮质激素释放激素神经元

    Cx3cr1-iCre

    脑内小胶质细胞

    Dbx1-IRES-CreERT2

    developing brain homeobox 1 gene (Dbx1) 表达组织,如中枢神经系统神经元前体等

    Drd1-2A-CreERT2

    多巴胺神经元

    Drd1a-CreERT2

    背侧纹状体、伏隔核和嗅结节

    Egr2-iCre (Krox-20Cre, KCN)

    在后脑,雪旺细胞和长骨

    Emx1-Cre

    大约88%的大脑皮层和海马神经元,以及大脑皮层的神经细胞

    Emx1-IRES-cre

    新皮质、海马神经元、大脑皮层的胶质细胞

    Eno2-CreERT2

    神经元及其他表达Eno2的细胞,除神经系统外的其他组织,肝脏、肾脏、心脏、脾脏也有Cre活性

    Eno2-iCre

    神经元及其他表达Eno2的细胞,除神经系统外的其他组织,肝脏、肾脏、心脏、脾脏也有Cre活性

    Etv1-CreERT2

    ER81阳性皮质神经元(包括第5层锥体神经元)

    Fev-Cre

    五羟色胺神经元

    Fos-CreERT2

    Fos表达的细胞/组织中;包括由特定体感、视觉和听觉刺激激活的神经元

    Foxg1-Cre

    cre的早期表达始于E8.5-E9.0的端脑。 在其他头部区域也观察到某些表达,例如耳囊,嗅觉斑,视囊前半部,咽内胚层,以及前肠的E10.5

    Gad2-IRES-iCre

    GAD2阳性神经元

    gfap-cre

    脑和脊髓中的星形胶质细胞、表达成体GFAP的神经干细胞

    Glp1r-IRES-iCre

    胃肠道迷走神经感觉神经元

    Gpr65-IRES-iCre

    胃肠道迷走神经感觉神经元

    品系编号

    品系名称

    方向

    T003856

    DBA/1JGpt-H11em1Cin(CAG-tdTomato)/Gpt

    荧光鼠

    T006163

    B6/JGpt-H11em1Cin(CAG-LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)/Gpt

    G/R双荧光

    T003575

    NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52

    Il2rgem26Cd22H11em1Cin(CAG-tdTomato)/Gpt

    免疫缺陷荧光鼠

    T002249

    B6/JGpt-Rosa26tm1Cin(CAG-loxP-STOP-loxP-Cas9-tdTomato)/Gpt

    Cre交配后,在特定Cre的组织中表达Cas9蛋白和红色荧光

    T004285

    B6/JGpt-Rosa26em1Cin(CAG-cas9-tdTomato)/Gpt

    荧光鼠

    T009408

    B6/JGpt-Rosa26em1Cin(SA-IRES-Loxp-ZsGreen-stop-Loxp-DTA)/Gpt

    未去除 LSL 时, 可以表达绿色荧光,用作报告基因

    T006772

    B6/JGpt-H11em1Cin(CAG-loxP-tdTomato)/Gpt

    荧光鼠


    集萃药康构建的 B6-ZsGreenLSL DTA 小鼠在未去除 LSL 时, 可以表达绿色荧光,用作报告基因。当与表达 Cre 重组酶的小鼠配繁时,在其后代小鼠表达 Cre 重组酶的组织细胞内,Floxed Stop 元件将在基因组中被删除,DTA 的表达被开启。因此,B6-ZsGreenLSL- DTA 模型不仅可用作报告基因,也可以结合Cre重组酶系统,进行特定细胞群的发育及功能研究。


    T002249 B6/JGpt-Rosa26tm1Cin(CAG-loxP-STOP-loxP-Cas9-tdTomato)/Gpt不可以观察到tdTomato红色荧光,在小鼠Rosa26位置插入了CAG-loxP-STOP-loxP-Cas9-tdTomato,STOP元件阻止了CAG驱动Cas9-tdTomato的表达。T002249 B6/JGpt-Rosa26tm1Cin(CAG-loxP-STOP-loxP-Cas9-tdTomato)/Gpt小鼠与全身表达或组织特异表达Cre重组酶的品系交配后,将会在表达Cre的细胞中删除STOP元件,开启Cas9和tdTomao的表达,此时可以观察到tdTomato红色荧光。激发波长554nm,发射光581nm。

    附:如果有需要查询的荧光蛋白激发光和发射光查询,可自行搜索如下网站。http://www.luyor.net/app/app156.html


    Granzyme B缺失的小鼠,品系编号为[T027256] ,B6/JGpt-Ctscem1Cd/Gpt ,预售状态,这个品系是Granzyme A和B同时失活。同时我们也有上游Granzyme B 的 inhibitor Serpinb9 KO的小鼠,它的敲除会导致Granzyme B量的升高,也是研究CTL(细胞毒性T淋巴细胞cytotoxic lymphocyte, CTL)免疫的一个重要的品系。


  • 小鼠制备常用技术及原理

  • 关于Cre-loxP重组酶系统的简要介绍

    Cre-ERT2概念

    快速将小鼠的背景进行转换的技术

  • 首先Cre-loxP重组是一种特定位点的重组酶技术,Cre是来源于噬菌体P1的一种酶蛋白,它可以识别催化两个loxP位点之间发生同源重组,从而在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位,用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激,对细胞中DNA进行修改。在真核和原核系统中均适用。而基因敲除是自80年代末发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,将目的基因用一段外源DNA序列(多采用筛选基因新霉素)替代,获得在整个发育时期的全身所有组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。然而,缺点有二:其一,很多基因经常是多组织多器官表达的,传统的全身敲除小鼠的表型是该基因在小鼠的所有组织中敲除的结果,很难研究该基因在某个特定组织中的作用;其二,很多基因(约15%的突变和缺失极易造成胚胎发育异常,导致胚胎致死或其他基因的表达失调致动物出生不久既死,更要想准确地研究基因在某组织中的功能,避免胚胎致死或动物出生后不久就死亡这种情况,此时可以采用条件性基因敲除策略,以Cre/loxP为基础,利用组织特异性启动子特异性控制Cre在特定组织的表达,以实现在特定组织细胞中对目的基因的敲除或改造,也可以在Cre后加上ERT2,以实现在动物的特定发育时期对目的基因的敲除或改造。即通过Cre/loxP系统,可实现目的基因的组织特异性敲除以及时间上进行控制,即可完成时空上的调控。


    ER(雌激素受体)的配体结合区(LBD)与Cre重组酶相结合,形成定位于胞浆中的融合蛋白(Cre-ER),为了避免内源雌激素的干扰,在配体结合区做一个点突变(G521R),使Cre-ER只响应外源雌激素(如TamoxiFen, 4-OHT)的诱导,命名为Cre-ERT。而另外一种配体结合区突变体融合蛋白被证明对外源雌激素的敏感性远高于Cre-ERT,这种突变体为Cre-ERT2,带有ER(雌激素受体)的配体结合区(LBD)中的3个点突变(C400V/M453A/L544A)。


    可以用遗传背景的检测来加快回交进程,目前我们就有SNP检测进行快速回交的技术,可缩短至五代时间。

    附参考文献:Narumi O , Kimiko I , Michiko H , et al. A High-Speed Congenic Strategy Using First-Wave Male Germ Cells[J]. Plos One, 2009, 4(3):e4943.


  • 斑点鼠计划

  • 斑点鼠是什么?斑点鼠的项目目标?

    斑点鼠合同周期问题?

    是否保证表型?

  • 价格低、交付周期短的敲除小鼠模型一直是市场的迫切需求。大规模制备小鼠模型建设现货小鼠产品资源库是实现这一目标的最佳途径。斑点鼠计划的目标是通过大规模小鼠 cKO/KO模型的制作,对小鼠基因组中可设计 cKO/KO 策略的所有蛋白编码基因和非编码基因逐一进行 cKO/KO 模型制作,获得小鼠全基因 cKO/KO 产品库,实现小鼠基因敲除模型的产品化,让小鼠购物体验。建成世界上最大的基因编辑小鼠品系资源库。


    最快 90天/3个月;

    ①正常销售 CKO 品系合同周期为 3-6 个月;

    ②研发中或没有搜到的 CKO 品系合同周期为 6-8 个月;

    ③KO 品系合同周期统一为 3-6 个月。



    斑点鼠的策略和精细设计是按照现有的生物学知识和现有数据库(NCBI,Ensembl,MGI等)中的基因信息设计,最大程度避免引起非预期表型。由于生命过程的复杂性,在现有技术水平下,无法预测目标基因编辑对基因组稳定性、基因的转录、RNA 剪接和加工、蛋白翻译和表型的全部影响,所以不能保证目标基因编辑能产生任何确定性或预期的后续变化,包括但不限于 RNA、蛋白和表型水平的确定性或预期的变化。

  • 代谢相关问题

  • 不同遗传背景肥胖/糖尿病模型鼠的对比

    BKS-DB鼠16周无论是实验组还是对照组均有约1/5的死亡的可能原因

    使用高脂饲料喂养B6小鼠,所有小鼠都能在10周后增重80%以上吗?

    小鼠饲料以及饮食诱导模型的介绍

    B6-OB、DIO和BKS-DB鼠的寿命

    BKS-DB鼠空腹血糖超过测量上限的原因

    BKS-DB采血进行血糖检测的方法及注意事项

    BKS-DB鼠出现体重下降,血糖升高的原因

    BKS-DB小鼠出现肥胖但血糖不高原因

    BKS-DB空腹血糖偶有低于10mmol/L的原因

    使用BKS-DB做ITT时,发现DB/m是注射后开始降血糖然后再回升,DB/DB是注射后血糖先上升再降,出现这个情况的原因?

    BKS-DB小鼠适合做GTT实验吗?

    BKS-DB小鼠饲养后出现皮肤伤口、咬饲料不吃的情况的可能原因

    BKS-DB用于糖肾模型的特征及检测指标

    BKS-DB空腹血糖禁食时间

    如何应对BKS-DB小鼠血糖爆表的情况

    实验动物尿液采集的标准操作规程(SOP)

    NOD小鼠血糖发病率

    ApoE-/-小鼠品系的表型特点

    ApoE-/-小鼠的普通饲料和模型饲料差异

    动脉粥样硬化模型ApoE-/-与LDLR-/-的区别

    生理笼检测内容

    代谢笼检测指标

    外来鼠能做哪些表型分析

    糖脂代谢紊乱小鼠模型有哪些?

    骨密度仪器提供的服务内容

    手术/药物诱导造模类实验的风险

    Apoe和Ldlr小鼠如果不用高脂饮食诱导是否会发病

    该如何进行随机血糖和空腹血糖检测的选择?

    小鼠脂质含量的测定方法

    葡萄糖耐受(OGTT)和胰岛素耐受检测(ITT) 方法

    如何进行摄食量(摄水量)检测?

  • 遗传背景显著影响着发病进程:

    C57BLKS/J背景(简称BKS背景)DB鼠:表型出严重的糖尿病症状(高血糖、高胰岛素血症、多种糖尿病并发症、胰岛萎缩等),并伴随明显的肥胖表征,寿命较短。

    C57BL/6J背景(简称B6背景)DB鼠:中轻度的糖尿病症状,明显的肥胖以及正常的寿命,血糖一过性升高后恢复正常。

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    可能是DB鼠出现糖尿病肾病、肝病、脑部病变等糖尿病并发症。可以建议客户解剖小鼠,观察小鼠肾脏及肝脏情况,如果发现小鼠肾脏变黑,肝脏发白,则是出现了糖尿病肾病、肝病等糖尿病并发症。


    不一定,B6小鼠会有一定的比例喂不胖,大致比例不超过15%,因此这类实验在设计实验时需要按10%-15%的富余量订购小鼠。


    小鼠饲料包括粗饲料和纯化饲料。一般造模使用纯化饲料。饲料的保存周期约为6个月,高脂饲料应放于-20℃保存,果糖的饲料要在干燥的环境下储存。合适的造模饲料需了解:实验目的模型、饲料的主要成分、动物的品系、参考文献。换饲料时过渡阶段:第一天:3/4旧饲料+1/4新饲料,第二天1/2旧饲料+1/2新饲料,第三天1/4旧饲料+3/4新饲料;第四天100%新饲料。

    造模饲料的应用:营养学研究与营养相关的其他学科研究;毒物或毒理学研究;模拟食物物理因素对人体机能的影响;可以单纯用饮食诱导疾病,如肥胖,胰岛素抵抗,动脉粥样硬化,脂肪肝,高血压等;可以用药物或手术联合饮食诱导疾病,如II型糖尿病 (STZ+高脂饲料),骨质疏松(OVX+特殊钙磷饲料,需要口服给药,但不希望通过灌胃的方式。新药研究多采用口服给药的方式。),其中 加药饲料强力霉素饲料用于TET诱导表达系统,利用强力霉素载体表达,控制特定的基因表达。

    通过高脂饮食诱导的肥胖模型,更好的模拟了人类疾病的发生发展过程,且模型构建过程简单,稳定性好,并具有易操作,周期短,可重复性高等特点,其中45kcal%和60kcal%的脂肪饲料是诱导肥胖模型的效果最理想的饲料。


    BKS-DB鼠寿命为十个月,但部分鼠在十几周之后会出现并发症,严重会死亡。B6-OB和DIO鼠寿命基本一年以上。


    电子血糖仪的测试上限为600mg/dL即(33.3mmol/L),再高的数值则超出测试量程会显示“HI”或 "HIGH"。测量下限为20~30mg/dL 即 1.1~1.6mmol/L.再低则超出测量下限,会出现"Lo"或“Low"标示。超过上限(33.3mmol/L)建议采用生化仪检测。


    超上限时会采用眼眶取血分离血浆,稀释后使用血生化仪检测。

    小鼠眼眶取血安全剂量是0.1mL/天,采太多对小鼠代谢影响比较大;大鼠建议采0.3-0.5mL/次,一天十次左右。

    测血脂应该将血液注入清洁干燥试管内,血清或血浆标本均适用于血脂、脂蛋白测定,推荐使用血清检测。

    不建议用肝素钠抗凝。


    BKS-DB小鼠可能出现糖尿病并发症现象,主要原因为血糖失控。由于胰岛素分泌不足,导致体内血糖过高,过高的血糖无法被细胞组织消耗利用,就会囤积在血液当中,机体就会去分解蛋白质和脂肪等来供给能量。再加上糖分随着尿液排出,水分丢失,营养流失,导致小鼠体重减轻、形体消瘦,甚至出现疲乏无力,精神不振。病程越长血糖越高,病情越重,消瘦也就越明显。


    会有小鼠肥胖但测得血糖不高,也存在测量不准确的问题,引起血糖不准的因素有很多,环境刺激,自身状况,测量时间,饱腹程度等都会影响血糖测定。


    空腹血糖低于10mmol/L的原因有很多:

    1)不同的禁食时间引起的血糖水平不同,4-8W的小鼠在禁食后有一定的比例出现血糖偏低的情况,该现象属于BKS-DB的正常血糖波动范围,建议客户在实验过程中考虑富余小鼠的预留,一般建议增加20-30%的富余量。

    2)环境刺激,自身状况,测量时间,饱腹程度等都会影响血糖的测定。SPF级动物房、 保证水和食物充足、 勤换垫料、 减少应激、 早上测试血糖、 统一采血方式、不同小鼠存在个体差异,到达后需要进行一段时间适应性饲养再进行实验以减小误差。

    3)测血样一般是从4周持续测到20周,6周龄小鼠的血糖才会明显高于野生型对照。

    建议如下:

    1. )检测血糖的时间最好在早上,这样小鼠在休息充分以及饮食足够的情况下,血糖结果更可信;同时采取第一滴血进行检测,

    2.) 饲养过程中,观察小鼠饮食饮水是否正常,随着小鼠体重增加,行动不便,饮食饮水的量也会影响血糖水平。

    3. )饲养高血糖小鼠时,应勤换垫料,一周两次。

    外源注射的insulin在体内的半衰期较短,一般认为注射30min后外源Insulin的不再发挥作用,所以对照小鼠会出现先降后升的现象。而DB小鼠的ITT数据显示,insulin注射后DB小鼠的血糖并没有出现显著的升高。


    不适合做。BKS-DB小鼠本底水平血糖值很高(8周龄后>50%小鼠血糖水平会超过血糖仪检测上限-33.3mol/L),在这种情况下进行常规OGTT实验会造成15-90min间的采血点血糖值超过血糖仪检测上限,无法判断药物的潜在效果。

    如果坚持进行OGTT实验,则只能鼠尾采血后进行稀释,然后使用血糖仪检测,该检测方法会有20%以上的误差。需要向客户做提前说明,如客户能接受则可执行。


    原因:

    1)BKS-DB血糖升高,多饮多尿,需要增加换笼频次,至少2d一次,每周至少3次。

    2)换笼周期长,小鼠会趴在垫料上移动身体,会造成表皮磨损。BKS-DB小鼠血糖高,伤口愈合缓慢,毛发皮肤长时间处于潮湿状态,容易出现皮肤溃烂不愈合。

    3)小鼠有磨牙情况,高脂饲料本身较软,加上笼盒内潮湿,可能会让饲料更软。

    建议:

    1)增加换笼频次,每周至少3次,放置合适密度的小鼠,每笼3只左右。

    2)皮肤损伤小鼠建议使用碘伏进行皮肤消毒,保持皮肤干燥。

    3)增加小鼠磨牙玩具。

    BKS-DB鼠会有肾病出现的情况,但是不是每个小鼠都会发生肾病。入组指标:BKS-DB小鼠24h尿微量蛋白含量在10周龄左右较对照有显著的提升。

    BKS-DB的糖肾病变主要集中表现在早期症状,与人糖尿病肾病早期症状相同,仅适合模拟糖肾的早期症状。小鼠第8周出现蛋白尿,16周肾部肥大,肾小球持续增大到25周,且16周龄时肾脏出现肾小球系膜基质增多,肾盂内炎性细胞浸润,肾间质纤维化等。肾脏检查有五个指标:尿素氮(BUN),血清肌酐(SCr)、HE染色、随机检测(不采用空腹检测血糖),尿液中肾功相关指标(BUN,CREA,mAlb等)的检测。肾脏组织学层面上(如基底膜增厚、纤维化等)发生比例较少,且成模时间较长。


    建议禁食5-6小时,禁食时间:8:00 am-3:00 pm。


    血糖爆表指血糖高于试纸检测上限(33.3mmol/L)。出现血糖爆表之后,一般采血眼眶或颌下取血的方式对BKS-DB小鼠进行采血(30ul左右),分离血浆并稀释,使用血生化仪检测。因涉及创伤,这种检测血糖的方法建议时间间隔在2周左右。此外这种方法不适合于BKS-DB小鼠的GTT检测,因为短时间内频繁采血会对动物产生强烈的应激,造成血糖数据不稳定。


    常用的采集方法较多,一般在实验前需给动物灌服一定量的水。

    (一)代谢笼法:此法较常用,适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便时,可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开,达到采集尿液的目的。

    由于大、小鼠尿量较少,操作中的损失和蒸发,各鼠膀胱排空不一致等原因,都可造成较大的误差,因此一般需收集5小时以上的尿液,最后取平均值。

    (二)导尿法:常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后,固定于手术台上。由尿道插入导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹),可以采到没有受到污染的尿液。

    (三)压迫膀胱法:在实验研究中,有时为了某种实验目的,要求间隔一定的时间,收集一次尿液,以观察药物的排泄情况。动物轻度麻醉后,实验人员用手在动物下腹部加压,手要轻柔而有力。当加的压力足以使动物膀胱括约肌松驰时,尿液会自动由尿道排出。此法适用于兔、狗等较大动物。

    (四)输尿管插管法:动物麻醉后,固定于手术台上。剪毛、消毒,于耻骨联合上缘之上在正中线做皮肤切口(长约3~4cm),沿腹中线切开腹壁及腹膜,找到膀胱翻出腹外。辨认清楚输尿管进入膀胱背侧的部位(膀胱三角)后,细心地分离出两侧输尿管,分别在近膀胱处穿线结扎。在离此结扎点约2cm 处的输尿管近肾段下方穿一根丝线。用眼科剪在管壁上剪一斜向肾侧的小切口,分别插入充满生理盐水的细塑料管( 插入端剪成斜面),用留置的线结扎固定。可见到尿滴从插管中流出( 头几滴是生理盐水),塑料管的另一端与带刻度的容器相连或接在记滴器上,以便记录尿量。在适用过程中应经常活动一下输尿管插管,以防阻塞。在切口和膀胱处应盖上温湿的生理盐水纱布。

    (五)膀胱插管法:腹部手术同输尿管插管。将膀胱翻出腹外后,用丝线结扎膀胱颈部,阻断它同尿道的通路。然后在膀胱顶部避开血管剪一小口,插入膀胱漏斗,用丝线做以荷包缝合固定。漏斗最好正对着输尿管的入口处。注意不要紧贴膀胱后壁而堵塞输尿管。下端接橡皮管插入带刻度的容器内以收集尿液。

    (六)穿刺膀胱法:动物麻醉后固定于手术台上,在耻骨联合之上腹正中线剪毛,消毒后进行穿刺,入皮后针头应稍改变一下角度,以避免穿刺后漏尿。

    (七)剖腹采尿法:同穿刺法做术前准备,皮肤准备范围应大一点。剖腹暴露膀胱,操作者的左手用无齿小平镊夹住一小部分膀胱,右手持针在小镊夹住的膀胱部位直视穿刺抽取尿液。可避免针头贴在膀胱壁上而抽不出尿液。

    (八)反射排尿法:适用于小鼠,因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故需采取少量尿液时,可提起小鼠,将排出的尿液接到带刻度的容器内。


    发病率与饲养环境、人员操作、小鼠饮食、微生物群等都有关系,所以会出现发病率百分比波动范围。集萃小鼠与文献中所提到的发病趋势是一样的。

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    (1)ApoE-/-血浆胆固醇高于正常动物。

    喂养的饲料中不同脂肪酸的比例不科学或者含有胆固醇,将加重高血脂和动脉粥样硬化的发生和发展。

    (2)ApoE-/-动物自发动脉粥样硬化(AS)。

    ApoE-/-动物随着月龄增加将出现类似动脉粥样硬化前期的损伤。

    (3)ApoE-/-动物表现为全身性的代谢和功能异常。

    *文献资料中常常是类似这样的表达“ApoE主要分布于极低密度脂蛋白(VLDL)、乳糜微粒(cM)及其残骸中”,注意,这是对血浆中ApoE的分布进行描述的。实际上,ApoE的合成来自于全身各部位的组织和细胞(主要是肝脏、脑和小肠,其余包括肾上腺、卵巢、单核巨噬细胞系统/网状内皮细胞)。ApoE合成的目的不仅是为了血浆中脂蛋白在转运和代谢,而且是与其合成部位的细胞功能的需求和代谢相一致的。当我们采用ApoE基因敲除动物开展研究时,一定不能忽略这一点,当用于研究高脂血症、动脉粥样硬化时,不要忘记其他多种器官、多种组织或者多种细胞的处于ApoE缺失状态,功能可能已经被改变。相似地,如果应用于研究ApoE在其他组织和器官中的功能时,不要忘记这种小鼠的血脂、血管、肝脏功能和形态学等方面可能存在的异常。


    ApoE-/-小鼠需要使用专门的日常普通喂养饲料及模型饲料。喂养大小鼠的普通饲料不适合ApoE-/-,也不适合作为模型饲料的对照饲料。建议采用代码为LAD0011的专用饲料(脂蛋白代谢及其相关的基因工程大鼠和小鼠的日常喂养饲料)。

    ApoE-/-小鼠在日常喂养饲料方面需要重视其质量,模型饲料中脂肪类型和含量以及胆固醇的水平对于动物机能和研究结果的可靠性和可重复性非常关键。目前市面上的模型饲料质量参差不齐,胆固醇原料的级别、纯度及其准确性非常重要;同时,饲料中的胆固醇在模型饲料中分布不均匀,将导致所喂养的动物血浆胆固醇波动较大或者不能按照预期的方向发展,或者导致研究结果不能被自己的实验室或其他研究者重复。

    研究动脉粥样硬化最好的动物模型为ApoE-/-。

    ApoE-/-为自发的动脉粥样硬化模型,与人的动脉粥样硬化进程更为相似。ApoE-/-小鼠的血浆总胆固醇水平比正常小鼠高,并且总胆固醇水平不随性别与年龄而改变。3月龄可在临近大动脉附近发现脂肪纹,病变随着年龄的增加而增大,发展病程中脂质少但细长细胞增多,典型的动脉粥样硬化病变前期的表现。在13月龄,小鼠的动脉粥样硬化病变从颈动脉、心脏和主动脉扩展到肾动脉和髂分叉。

    主动脉弓油红O染色:

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    LDLR-/-只有在高胆固醇饲料喂养下才会出现动脉粥样硬化斑块,普通饲料无法诱导斑块的出现。高胆固醇饲料喂养12周后:小鼠出现主动脉广泛的内膜增厚及60%-80%表面苏丹染色阳性,动脉粥样硬化病变处出现内皮破裂,巨噬细胞及泡沫细胞聚集。

    生理笼可以检测单只动物:a、24小时的饮水,b、24小时的摄食,c、收集24小时尿液,d、收集24小时粪便。普通笼位也可以检测饮水和摄食,但检测数据为每笼动物饮水和摄食的平均值。


    检测指标: BW(体重)、VO2(氧气消耗量)、VCO2(二氧化碳的生成量)、RER(呼吸交换率,RER=VCO2/ VO2)、HEAT(产热值,计算消耗氧气所产生的热量)、Total activity(XTOT)、总的行为活动、 Ambulatory activity(XAMB)(走动行为)、 FEED(食物的摄取量)。


    外来活体鼠可以做代谢笼实验(表型分析仪器均在屏障设施内);经生物净化及代繁的小鼠可以做我们公司所有的表型分析实验。

    表型筛选全流程

    组织病理学检测服务

    PDX/CDX模型构建与药效测试

    血液学检测

    小鼠胚胎分析

    分子生物学

    开场

    取材

    P1代肿瘤建模

    血生化全套检测

    取胚胎(1个时间点(E9.5至出生前),3只以上孕鼠20个以上胚胎,整体胚胎串拍照,基因型鉴定)、拍照、石蜡包埋等

    组织总RNA提取

    SHIRPA

    脱钙

    P2代肿瘤传代

    血糖(Glu)

    RT-PCR

    抓力测定实验

    组织包埋

    P2/P3代药效实验

    甘油三酯(TG)

    荧光定量PCR

    震惊反射实验

    切片

    CDX建模

    胆固醇(Chol)

    组织总蛋白提取

    代谢笼

    HE染色

    CDX建模药效实验

    高密度脂蛋白胆固醇(HDL)

    Western blot

    心脏超声

    抗体测试


    低密度脂蛋白胆固醇(LDL)

    剥离胚胎


    IPGTT

    免疫组化染色(单染)


    白蛋白(ALB)

    基因型鉴定(PCR


    骨密度检测试验

    免疫组化染色(双染)


    总蛋白(TP)

    基因型鉴定(PCR+测序)


    X光拍照

    免疫荧光单标记检测


    谷丙转氨酶(ALT)

    解剖镜下单胚胎侧面照


    听力脑干反射试验

    免疫荧光双标记检测


    谷草转氨酶(AST)

    样品固定、石蜡包埋


    眼形态检测

    免疫荧光普通拍照(单标)


    碱性磷酸酶(AKP)



    眼底层检测

    免疫荧光普通拍照(双标)


    总胆红素(TBIL)



    血常规检测

    免疫荧光共聚焦显微镜拍照(单标)


    肌酐(CREA)



    血生化检测

    免疫荧光共聚焦显微镜拍照(双标)


    尿素氮(BUN)



    脾脏流式细胞检测

    化学染色(PASM,masson's,六胺银等)


    血钙(Ca)



    称体重

    普通拍照


    血清磷(P)



    组织采集

    全切片扫描


    血清铁(Iron)



    组织包埋

    HE组织病理学诊断





    整套试验期间饲养

    IHC结果分析





    类型

    小鼠名称

    是否基因改造

    饮食/药物诱导

    I型糖尿病模型

    NOD (non-obese diabetic)

    -

    -

    高剂量STZ诱导C57BL/6J小鼠


    II型糖尿病模型

    BKS-DB小鼠


    DIO (diet induced obese) 小鼠


    HFD配合低剂量STZ诱导C57BL/6J小鼠


    肥胖模型

    DIO (diet induced obese)


    B6-ob小鼠


    动脉粥样硬化模型

    ApoE


    Ldlr



    体脂比、骨矿物质含量以及骨矿物质密度。


    利用手术/药物诱导造模均存在实验失败的风险。原因包括手术失败、动物对药物的耐受不一、药物批次间品质差异等,因此很难100%成功造模。此外模型的发病程度在不同批次实验间也会存在细微的差异。所以为保证提供给客户的模型小鼠都合格,需根据不同模型的经验成功率准备富余备用鼠,如有条件可以设立先导模型组,在正式交付模型前进行相关病理组织学或其他造模指标的检测,确认该批次模型的发病程度。


    ApoE KO小鼠在正常饮食下会自发形成动脉粥样硬化,但需要的时间很长(半年以上)。Ldlr KO小鼠在非西方饮食喂养下不会自发动脉粥样硬化。


    空腹血糖受动物进食的影响较小,其指导意义大于餐后(随机)血糖。但空腹血糖需要对小鼠进行禁食操作,不宜在短时间内连续开展(频率需大于每周/次),特别是对于严重糖尿病模型(如BKS-db);而餐后血糖可以最高以每天/次的频率开展,可以对小鼠进行密集检测。选用何种方法需要根据客户的实验目的或是药物的特性进行讨论。


    小鼠正常日粮饲养或禁食过夜后尾静脉采血,离心后取血清,分别使用游离脂肪酸(NFFA),甘油三酸酯(TG)和总胆固醇(TC)试剂盒测量血清中相应脂质的含量。


    葡萄糖耐受检测(OGTT):小鼠禁食过夜(16小时)后, 通过口服管饲法给予葡萄糖大剂量(1.5mg / g),使用Breeze 2血糖仪将小鼠尾巴放血以测量血糖。

    胰岛素耐受检测(ITT):小鼠禁食过夜(16小时)后,通过小鼠腹膜内注射胰岛素(0.75 mU / g),使用 Breeze 2血糖仪将小鼠尾巴放血以测量血糖。

    检测前一天更换垫料,称取新饲料并替换原来的饲料;24小时后再次称取笼架上以及笼盒内掉落的大块饲料重量,二者的差值即为此笼小鼠24小时的摄食量,以此总量除以此笼内小鼠的数量即为每只小鼠的24小时内小鼠平均摄食量。摄水量的检测方式类似。


  • 免疫缺陷相关问题

  • 免疫缺陷小鼠的发展历程?

    各种免疫缺陷鼠的对比及研究应用选择

    与其他免疫缺陷小鼠相比,NCG 小鼠在CDX和PDX应用中的优点

    NCG小鼠的巨噬细胞是缺失还是减少?

    裸鼠的特点

    NOD小鼠的特点

    集萃NCG相关品系特点

    NCG-huPBMC模型使用冷冻外周血还是鲜外周血比较好,窗口期多久

    NCG小鼠的饲养要点

    无毛NCG大龄后皮肤出现白点原因?

    NCG饲养过程中出现死亡,并有心脏包膜、 肺充血、 脾脏肿大、大肠杆菌的原因

    NCG饲养过程中,会出现小鼠活动差,饮食下降导致体重下降,被毛不光泽原因?

    NCG成瘤性不理想的原因

    检测T、B、NK、巨噬细胞分别可以对哪些marker进行检测

    为什么huHSC免疫重建小鼠模型需要辐照,而PBMC不需要

    HSC重建为什么以人源CD45+百分比作为标准

    HSC免疫重建为何都用雌鼠

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    NOD-scid:适合同种异种移植;自发胸腺淋巴瘤,寿命短,不适合长期的移植实验。

    NCG:可高效植入HSC、 PBMC,目前最适合人源细胞或组织移植的工具鼠。

    Hairless NCG(Hr基因knock down):相对于NCG,无需剃毛,便于肿瘤观察及测量。

    Nude(Foxn1自发突变):无毛,评价皮下肿瘤生长时无需剃毛;但B/NK细胞存在,不适合作为血源性癌症(白血病等)宿主。

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    1.免疫缺陷程度高,对人源细胞和人源组织几乎没有排斥;

    2.更好保持原发肿瘤的组织学特性、分子标志物特性和药物敏感性特性;

    3.遗传背景清晰,实验数据差异小;

    4.可接种的CDX种类及数量多,成瘤能力优于其它免疫缺陷小鼠。

    NCG小鼠来源于NOD背景鼠上进行Prkdc和Il2Rg突变,有以下基本特征:

    1) NOD(non-obesediabetes)遗传背景,自发I型糖尿病,其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱,先天免疫系统(如补体系统和树突状细胞)功能降低;

    2) Prkdc (protein kinase DNA-activated catalytic)基因突变,小鼠的功能性T和B细胞缺失,淋巴细胞减少,表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, scid);

    3) Il2rg null: Interleukin-2受体的gamma链(IL-2R γc,又称CD132)位于小鼠X染色体上,是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基,该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低,尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

    综上所述,所以NCG小鼠由于其背景为NOD,故其巨噬细胞有缺陷,但并不是没有。


    裸鼠(Nude, Foxn1自发突变)是一种免疫缺陷小鼠模型,先天性无毛,无胸腺, T细胞功能完全缺陷,对异种移植不产生排斥反应,因此适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。

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    非肥胖型糖尿病小鼠(NOD/ShiLtJ)是目前最常用的胰岛素依赖、Ⅰ型糖尿病的模型。通过病理学观察发现,NOD小鼠自身免疫性胰岛炎最早发生于4周龄,因而可能影响受孕率,导致早期发病小鼠不孕,发病较晚的小鼠受孕后平均初产天数、平均产仔数、平均离乳数、平均离乳率以及平均胎间隔都未受影响。对该品系小鼠的选种,宜将离乳幼鼠均予保留,发现亲代发病,则需及时交配。

    NOD小鼠发病后,充分呈现该品系小鼠糖尿病的生理生化特征即:尿频、多饮、高血糖的症状。在几周的时间内,血糖迅速升高,饮水量剧增,大量地排尿,体重迅速下降,在这个过程中,患鼠血糖呈先迅速上升,后逐步下降,但仍维持高于正常值的状态,体重直线下降,最后昏迷而死亡。

    在适当的动物饲料饲喂下,雌性NOD小鼠6—7月龄时糖尿病发病率可达70%~80%。发病率与饲料有关。经121℃、30rain高压蒸汽灭菌后饲喂,高压蒸汽灭菌会破坏饲料的营养成份,尤其对蛋白质、脂肪、水溶性维生素的破坏较严重。在NOD小鼠离乳后分别给予高蛋白饮食(蛋白质含量55%)和低蛋白饮食(蛋白质含量15%)饲喂,发现高蛋白饮食组平均糖尿病发病时间(19.7土1.3d)较低蛋白饮食组(23.5~1.1d)两者经检验差异显著(P<0.05)。

    品系名称

    特点

    优势

    NCG-GM3

    将编码人IL-3GM-CSF基因转入到NCG小鼠

    1、   建模移植时间短;

    2、   分化出更多的髓系细胞、功能性NK细胞;

    3、   人免疫系统重建率更高。

    NCG-hIL15

    IL-15基因原位替换鼠源IL15NCG小鼠

    1、支持人NK细胞的增殖,分化;

    2、重建的NK细胞表达颗粒酶A和穿孔素;

    3、研究ADCC动物模型。

    NCG-B2M

    NCG小鼠的基础上敲除B2M基因

    B2M 基因缺陷会影响 MHC I  MHC Ⅱ的功能,减轻PBMCGvHD反应,提高小鼠生存期。

    NCG-HLA-A2.1

    NCG小鼠的基础上将HLA人源化

    有利于CD8+ T Cell 的成熟。

    NCG-tdTomato

    NCG小鼠中转入CAG-tdTomato

    小鼠品系在全身组织中表达红色荧光,因此 NCG-tdTomato 是理想的人造血干细胞和外周血单核细胞移植受体,应用于区别本体和植入体。

    BALB/c-nu

    Foxn1自发突变

    1、无毛,适合皮肤病研究;

    2T细胞缺陷;

    3、体型大有利于病灶观察;

    4、小鼠生命周期长。

    NCG

    PrkdcIl2rg基因敲除

    1、   TB细胞、NK细胞缺失;

    2、   CDXPDX

    Rag1

    rag1基因敲除

    胸腺、脾脏变小,成熟T细胞、成熟B细胞缺失更彻底,不会有泄露leak”NK细胞比例略增加。

    PBMC使用前需进行检测,此期间可将PBMC在液氮中冷冻保存。复苏的PBMC的使用时会确认活性没有问再使用,窗口期为5-8周。

    附参考文献:Tissue-Specific Oncogenic Activity of KRASA146T.[J]. Cancer Discovery, 2019.


    主要有以下几个方面:

    • 饮水:氯化;饲料:高压料;垫料:米芯垫料;

    • 所有接触物品须经高压或通过其他方式灭菌;

    • 每周换笼:防止共生微生物的富集,对NCG小鼠带来感染的可能。

    • PPE操作(无菌)

    • 抓取小鼠时用消毒过的镊子夹取或者用酒精消毒双手后抓取。

    • 个人防护要求无论何时都不能有暴露的皮肤在外,发帽、连体净化服、口罩、双层手套。


    如果表型为白色鳞屑状,则需确认饲养环境是否有微生物污染,可能是感染牛棒杆菌。

    一般无毛NCG皮肤出现皮肤白色突起是由于毛发基因的插入导致毛发发育异常,毛囊发育阻滞,毛囊部分角化或皮脂腺增生所致,且随着年龄的增长变得严重。

    如果饲养环境不良,无毛NCG可能的伴随表型还包括可能的皮肤炎症及皮肤角质化严重的综合表现。


    NCG由于是严重的免疫缺陷模型,因此对病原体易感性增加,对饲养环境的要求很高, 最好是SPF级。如果不采取适当的措施来确保足够清洁的环境,肠道共生微生物会在NCG小鼠中引起病理变化。由于小鼠个体差异,身体机能差异,应激反应、饲养环境改变等,会使非SPF级菌扶植,引起肠系膜变薄,肠屏障破坏,能够促使肠道菌群移位,引起肝脏、脾脏等感染。


    NCG小鼠毛发相比其它小鼠,色泽本身会存在一些差异,属于正常现象。但如果NCG小鼠活动差,饮食下降,体重下降和被毛不光泽,需考虑饲养环境等因素。饲养过程中小鼠的状态及饮食和环境关系很大,需要了解清楚饲养动物设施的具体情况进一步分析出现异常的原因。


    荷瘤效果影响因素很多。 首先细胞株自身的成瘤性、 细胞接种时的活力、 支原体污染、 接种的剂量、 方式(皮下、 静脉、 原位等) 、 选择的免疫缺陷小鼠、 小鼠的性别、 年龄、 饲养的环境、其他辅助因子(如matrigel、 hormone), 都有可能会影响到最终的结果。此外, 小鼠在运输过程中会产生应激反应, 应激反应会使小鼠出现一系列的病理生理学变化, 这些变化会增加某些实验误差, 因此客户在接到动物后应尽量避免立即进行实验, 而是应该根据运输时间让动物有2-7天的适应期。


    ①B细胞:CD45R/B220是小鼠全B细胞标记marker(活化T细胞、NK细胞也有表达),CD19是B细胞特异的标记。

    ② T细胞:小鼠常用的T细胞标记CD3。CD4+T为辅助性T细胞、CD8+T为杀伤性T细胞。小鼠记忆T细胞标记有CD44、CD62L。活化T细胞标记有CD152(CTLA- 4)、CD154(gp39)、CD134(OX- 40)、CD69等。

     ③NK细胞:常用CD335、CD49b标记小鼠的NK细胞;NK1.1(CD161)只能用于C57BL/6、NZB、FVB/N小鼠品系。

    ④ 巨噬细胞:小鼠常用的检测指标为CD11b、F4/80;对于M1,M2亚型分析,可参考以下 marker 和 soluble mediators两方面进行评价,不同组织中的标记物会有差异。

    M1:

    surface marker: CD80, CD86,MHC II等

    soluble mediators:IL-12, IL-6, IL-1,TNF-α,IL-23,RNI,ROI,iNOS等

     M2:

    surface marker: CD206,CD301,CD163,SLAM等

    soluble mediators:IL-10,RELM-a, Arg-1,Ym1等


    因为HSC需要清髓,PBMC为外周血不需要清髓。

    辐照可以清除小鼠骨髓中的干细胞,从而提高人源HSC移植后的重建水平,因此选用辐照处理后的NCG小鼠移植人源HSC。


    CD45+为白细胞的marker,国际采用此标准作为人源化成功的标志。HuPBMC-NCG免疫重建的标准hCD45+≥ 40 %,huHSC-NCG免疫重建的标准hCD45+≥ 25 %


    一定程度上,不同窝雌鼠易群养,雄鼠虽然产生的抗体会比雌鼠高,但不易群养。雌性小鼠通常不会打斗,整群饲养的雄性小鼠则时常打斗。将二只或二只以上的成年公小鼠关在一起通常是无法和平相处的;新近组合的公鼠群,新的公鼠进入已被划定的领域,或先前独自饲养的小鼠等,皆有可能发生打斗,雌性鼠则较少发生打斗现象。

    另外已有研究发现,雌激素与免疫系统的发育有关,促进抗自身抗体的产生,促进巨噬细胞的功能等。


  • 肿瘤免疫

  • 在人源化小鼠系统中,LAG3的配体分子有哪些

    PD1人源化模型的策略和优势

    在人源化小鼠模型中,鼠自身表达的PD-L1能否与人的PD-1相互作用

    hCD3e品系为什么只对mCD3e胞外区人源化改造

    免疫检查点疗法有一些副作用,为什么还在开发多靶点联用?如何降低毒性?

    不同的免疫检查点之间如何联用

    免疫检查点人源化小鼠和免疫重建小鼠的选用

  • 已知MHCⅡ是作为LAG3的配体之一,LAG3人源化小鼠(小鼠肿瘤细胞系)没有人MHCⅡ分子。人的LAG3是否与鼠的MHC结合,理论上,人源化的LAG3可以与小鼠来源的MHC II和FGL结合,但在体内尚未得到证实。不同的靶点与相应的配体有不同的结合亲和性,有些靶点可能不匹配,表现为免疫系统异常,如CTLA4。但我们的数据显示,LAG3人源化小鼠的免疫系统没有明显异常。


    首先PD1蛋白结构大致分为三个部分胞内区,跨膜区和胞外区。胞内区连接细胞内下游信号通路,我司的PD1人源化模型保留了小鼠原本的PD1的胞内区,以确保胞内信号的传递。而胞外区是抗体识别部分,胞外区最核心的是IgV-domain,这也是PDL1的识别位点。例如,keytruda抗体(Pembrolizumab)识别的是IgV-domain,评价这类抗体需要将鼠源lgv-domain替换称成人的。Opdiva抗体(Nivolumab)除了识别IgV-domain之外,还识别旁边的N-loop区,对于这样的抗体,如果只换IgV-domain的话,在模型上就会显示这种抗体没有疗效。因此我司选择将PD1的胞外区进行了全人源化改造(信号肽部分除外),从而实现成药靶点的全覆盖,避免在进行药效评价的时候漏掉一些可能存在的有疗效的抗体,并有B6和BALB/C两个背景可供选择。

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    尽管鼠源PD-L1与人源PD-1结合的亲和力没有同源的高,但鼠源PDL1和人源PD1可以相互作用,反之亦然,它们之间的相互作用是单靶点人源化小鼠模型创制的基础。

    CD3E是CD3共受体的四个亚基之一,与T细胞受体(TCR)结合参与抗原识别与细胞内信号转导,在免疫应答中具有重要作用,另外CD3e( CD3e molecule)编码CD3-epsilon多肽,与CD3-gamma,-delta,-zeta和体细胞受体alpha/beta或gamma/delta共同构成TCR-CD3复合物。此复合物在抗原识别和细胞内信号转导途径方面起着非常重要的作用。将mCD3e全人源化替换为hCD3e,对纯合后代脾脏,胸腺,PBMC及淋巴结进行流式细胞分析,观察小鼠T细胞发育的研究结果表明,相对于野生型,hCD3e全人源化纯合小鼠脾脏,胸腺,PBMC及淋巴结中mCD3+细胞含量较低且CD4、CD8分化差异较大,表明全人源化策略致其T细胞发育过程受阻,此方案制备的小鼠并不适于后续药理药效评价。在此基础上,考虑到全人源化可能对mCD3e胞内信号传递的影响,因此仅对mCD3e进行胞外区人源化改造,保留其鼠源的信号传导功能,得到B-hCD3e mice.同样对其纯合后代脾脏,胸腺,PBMC及淋巴结进行流式细胞分析,结果表明,mCD3e胞外区人源化纯合小鼠(B-hCD3e mice)脾脏,胸腺,PBMC及淋巴结中,各细胞细胞比例与野生型小鼠相比无显著差异,表明T细胞分化未受胞外区人源化改造影响,适用于后期双特异性抗体药物的药效评价。


    客观来讲,在肿瘤的治疗方案开发中,无论化疗,放射疗法,药物治疗等都有潜在的副作用,且治标不治本,随着免疫检查点在癌症治疗的报道,尤其是免疫检查点药物PD-1/PD-L1抗体,作为目前抗癌领域最耀眼的“明星”,为癌症的治疗带来了前所未有的突破,在抑制肿瘤生长、维持疾病稳定以及延长患者的生存时间上取得了令人瞩目的效果。由于各个免疫检查点在肿瘤免疫中有着相似或不同的功能,多靶点联用意在开发在肿瘤免疫治疗中的不同方案,也可能对降低毒性有所帮助。


    可根据免疫检查点的特点以及研究目的选择靶点,例如相同效应(免疫抑制)的靶点联用,相反效应(免疫激活与免疫抑制)的联用,大分子药物以及小分子化药进行联用,以达到增强药效或者降低单用毒性等目的。


    免疫检查点小鼠具有健全的免疫系统和人源化的特定靶点,可以用于评价特定靶点的抗肿瘤效果。免疫重建小鼠的优势在于可以重塑部分人的免疫系统,目前主要可重建的细胞类型T(huHSC-NCG)、NK细胞(huHSC-NCG-hIL15)等,因此可用于靶向T或NK细胞的抗肿瘤效果。如果没有特定靶点的免疫检查点人源化小鼠的时候选用免疫重建模型。


  • 功能药效服务

  • 小鼠荷瘤模型类型

    CDX和PDX的比较

    药康已验证的人源CDX细胞系

    CDX建模及药效实验流程

    用客户的细胞系做成瘤或药效实验的说明

    荷瘤实验的注意事项

    PDX建模流程

    为什么在设计方案的时候需要在客户要求的入组数量的基础上增加小鼠的订购量?

    无菌小鼠实验平台可以开展对外服务包括哪些?

    无菌小鼠实验与SPF小鼠实验相比,有什么特殊性?

  • 小鼠肿瘤移植模型是目前抗肿瘤药物临床前药效学评价最常用的体内模型。根据供体和受体的来源不同,分为两类,一种是同种移植模型,选用鼠源的肿瘤,接种到免疫正常的同背景小鼠体内,可用于免疫调节类药物的筛选。另一种是异种移植模型,即选用人源的肿瘤,接种到免疫缺陷小鼠体内,一般用于化疗、靶向药物的筛选。异种移植模型,根据移植物的不同,又可以分为肿瘤细胞株移植模型,和病人来源肿瘤瘤块移植模型。


    (1).人源肿瘤细胞系异种移植(cell derived xenograft,CDX),即将体外传代培养的肿瘤细胞接种至免疫缺陷小鼠,接种部位常为皮下、静脉或原位。

    优点: CDX模型细胞系容易获得,有大量已发表的文献关于其基因组学、细胞功能学及药效反应的数据可供参考,建模成本低等。

    缺点:人源肿瘤细胞系经长期体外培养后,其肿瘤细胞生物学行为及基因谱表达水平、 肿瘤异质性都与原始肿瘤组织存在较大的差异,在临床药效方面的预测效果不甚理想。

    (2).人源肿瘤组织来源移植瘤模型 (patient derived xenograft,PDX),通过将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型,常见接种部位为皮下或原位。

    优点:移植所用标本直接来源于人体肿瘤组织,未经过体外培养,稳定地保留了肿瘤的遗传特性、组织学和表型特征,即肿瘤异质性。且PDX可用于筛选化疗药物敏感或耐药标记物,其试验结果具有较好的临床预见性。除此外,PDX在移植过程中较好地保留了肿瘤间质和干细胞成分,使得肿瘤的生长微环境更接近实际情况,还可为肿瘤样本的保存和传代提供大量标本。

    缺点:目前PDX模型原始肿瘤的主要来源为手术切除,建模难度高且不能反复获取,构建时间长且成功率不稳定,随着传代次数增加肿瘤微环境也会逐渐被小鼠细胞外基质取代,因此对于传代次数有一定限制,一般样品传代不超过10代。

    CDX和PDX荷瘤鼠均为免疫缺陷的小鼠,因此无法用于免疫相关药物的筛选。

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    客户寄送的细胞系需要经过我方的支原体检测后方能开展实验,因为支原体是SPF动物房禁止带入的微生物,也会对成瘤性测试或药效实验带来不准确的实验结果。客户可提供该细胞的小样,通过后方可启动正式实验;正式实验细胞注射后还会留取小样再进行复检。

    荷瘤试验成功与否受很多因素的影响,细胞系自身的成瘤性、细胞活力、支原体污染、接种剂量、接种方式(皮下、 静脉、 原位等)、选择的免疫缺陷小鼠、小鼠的性别、年龄、饲养的环境、其他辅助因子(如matrigel、 hormone)等,都有可能会影响到最终的结果。因此对于客户的细胞系我们会先做小规模的成瘤性测试,摸索成瘤条件,但不保证一定会成功。


    (1) 根据文献选择合适的细胞剂量,过多或过少都会影响荷瘤成功率。

    (2) 可以在肿瘤细胞中加入基质胶,低温条件下与肿瘤细胞1:1混匀再进行荷瘤,可加速肿瘤细胞生长。

    (3) 正式实验时一只小鼠尽量只在一个位置接种,多位点接种会有相互影响的可能性。

    (4) 药效评价实验中,不要人为的用各种方法促进肿瘤细胞生长,造模时间过短,肿瘤细胞生长过快可能导致接种部位溃烂,由于小鼠具有嗜血性,同笼中的其它小鼠会啃咬其溃烂部位,加速小鼠死亡,影响实验结果。

    荷瘤实验是否成功受很多因素的影响,以上建议仅供参考。

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    小鼠生理指标存在个体间存在差异,比如BKS-db小鼠在药效实验前需要进行体重和血糖等指标检测,会有10%左右的个体不符合入组要求(体重太轻或血糖不达标)。此外在手术/诱导类造模实验过程中可能存在动物意外死亡的情况,因此也需要额外订购10%左右的小鼠作为备用。


    目前集萃药康可提供无菌小鼠销售、小鼠无菌超级净化业务、无菌小鼠代理繁育业务及无菌小鼠实验业务(肠道微生物的重建、终点样品采集(生物安全柜操作)和表型分析(SPF级环境,具体案例具体分析)以及中间过程中简单的隔离包内操作),全方位服务您的无菌小鼠相关研究。


    目前公司的屏障设施均为SPF级。SPF小鼠的操作可以在设施内开放进行,空间不受限制,能使用的仪器设备较多,实验的内容相对丰富。无菌小鼠饲养以及后续的无菌小鼠实验,需要在无菌环境中进行。这种无菌环境通过无菌隔离包来实现。进入的所有物料都要经过严格的无菌处理。隔离包的空间限制、物料的无菌要求和环境控制,导致无菌小鼠实验内容必须“从简”。在研究之初,就要考虑无菌小鼠实验的受限特点,设计最少、最简单的实验,解决最核心的问题。


  • 基因型鉴定问题

  • 客户取小鼠组织DNA样品鉴定无阳性条带或条带较弱,如何筛查问题?

    鉴定过程中常见问题及解决办法

    集萃PCR鉴定中使用的对照和内参一般是什么?

    集萃cKO小鼠PCR鉴定在目标条带的附近扩增出非特异性条带的原因

  • A.模板:漏加、降解或模板中残留过量蛋白,模板中存在抑制物影响了 PCR 反应,如抽提过程中残留酚抑制聚合酶活性,或者残留酒精导致点样时样品不能有效沉降到胶孔中,需要根据内参或对照样品综合判断;

    B. 试剂:附集萃鉴定组所用相关试剂品牌如下:(可提供客户参考)

    体系

    公司

    短距离PCR反应Taq酶体系

    博彩生物

    2×Taq Master MixDye Plus

    诺唯赞

    长距离PCR反应LA Taq酶体系

    TaKaRa

    2×Prime STAR Max Premix

    TaKaRa

    C.凝胶:没有添加双链嵌合染料,如 EB 或染料加入过早,在凝胶高温状态下挥发过多,凝胶质量不高,造成胶孔处有大量残留物;

    D.程序:反应中的退火温度不合适或选用的聚合酶不合适,可根据阳性对照和以前的鉴定报告综合判断。(Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言30-35轮循环已足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加,在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。)

    综上:根据上面的问题分类,让客户自查,鉴定的过程中务必设置对照,如果客户自查后仍未解决问题,建议填写售后表单,走售后流程。

    A:DNA 带模糊

    1) DNA降解:避免核酸酶污染;

    2) 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液;

    3) DNA 上样量过多:减少凝胶中 DNA 上样量;

    4) DNA 样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐;

    5) 有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白;

    6) DNA 变性:电泳前勿加热,可用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA;

    7)凝胶制备:胶的浓度不当、煮胶时间过长或过短、凝胶未在4度妥善保管或是放置时间过久未使用;

    B:不规则 DNA 带迁移

    1) 对于λ/Hind III 片段 cos 位点复性:电泳前于 65℃加热 DNA 5分钟,然后在冰上冷却 5 分钟;

    2) 电泳条件不合适:电泳电压不超过 20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液;

    3) DNA 变性: 可以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA,电泳前勿加热。

    C:DNA 带缺失

    1) 小 DNA 带走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;

    2) 分子大小相近的 DNA 带不易分辨:增加电泳时间,增大凝胶浓度;

    3) DNA 变性:电泳前请勿高温加热 DNA 链,以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA;

    D:DNA 电泳的 Marker条带模糊、扭曲或分离不充分

    1)电泳时缓冲液必须高过液面,1-2mm即可。

    2)电泳时电压过高。

    3)上样时缓慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

    4)电泳液多次重复使用也可导致此情况的发生,可尝试重新配置。

    5)尝试低压条件下多跑一段时间,让marker的条带充分分离。

    PCR鉴定中的对照

    阳性对照: Positive,P,通常使用阳性的质粒/细胞/小鼠基因组DNA作为阳性对照;

    阴性对照: Negative,通常使用背景品系的基因组DNA作为阴性对照,如 B6;

    野生型对照:wildtype, wt

    空白对照:blank,N,为无模板的PCR反应体系;

    内参:参考鉴定方案,每种情况各不相同,除空白对照外,每个样品都能扩增出条带的引物组合,可以检测模板是否正常。


    对于CKO模型,由于flox与wt的PCR产物存在约200bp同源区域,所以杂合子模型的扩增产物,在PCR复性过程中,有可能存在少量flox单链与wt单链互相结合的产物,所以电泳可能会跑出3条带。该现象受序列本身及扩增条件影响,如果希望得到更漂亮的图,可以尝试提高2-4℃复性温度进行调整,优先推荐使用降落PCR条件扩增。



  • 技术服务类FAQ

  • 技术服务类型介绍

    常规的全身性敲除KO与条件性敲除CKO有什么区别?

    为什么在拿到嵌合体(或Founder)小鼠以后要与野生型的小鼠回交?

    转基因小鼠特点,能否制作组织特异性表达的转基因鼠?

    Cre-loxP重组酶系统的作用方式

    如何在时间上实现调控基因的表达?

    转基因或基因打靶类小鼠的命名规则

    ES打靶和Cas9打靶流程有哪些区别?

    为何ES打靶类项目需要去除模型中的Neomycin筛选标记?

    RES,linker及2A的区别

    TG与H11/Rosa26位点定点表达模型的区别

    什么是小鼠表型分析,IMPC以及AMPC又分别指什么?

  • 我们能够为您提供转基因、利用同源重组方式制作的KO及CKO(包含敲入、点突变和KO First)以及利用Cas9技术制作的KO或CKO(包含敲入、点突变)小鼠模型等一站式模型定制服务。

    除此之外,我们还可以提供如下服务:

    ES细胞囊胚注射,Cas9显微注射,单精注射等其他胚胎类服务。

    各类型载体构建,以及打靶载体的ES细胞电转与筛选服务。

    基因型检测;SNP分型检测等。

    Cas9类服务常见的模型方案如下:

    Cas9-KO:

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    Cas9-CKO:

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    H11-Cas9-KI:

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    Cas9-KI:

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    Cas9-TM:

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    基因敲除技术是针对某个基因序列进行修饰、改造或删除,从而改变生物的遗传性状,令特定的基因功能丧失。基因敲除包括全身性敲除和条件性敲除。

    全身性敲除是通过基因打靶,将大/小鼠特定的基因敲除后,其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对大/小鼠全身生理病理的影响。

    条件性敲除模型是通过基因打靶,把两个loxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前,其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可以在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其他组织或细胞表达正常。

    条件性基因敲除鼠适用范围为:(1)该基因有胚胎致死性;(2)用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。

    实现条件性基因敲除(conditional knock-out),需要两种小鼠进行交配:

    a)  带有两个loxP位点的Flox 小鼠

    b)  组织特异性表达Cre的小鼠。如心脏特异性表达Cre的小鼠

    囊胚注射(注射的ES细胞具有全能性,所以可以和原胚胎镶嵌发育)、胚胎移植后出生的小鼠中,经过鉴定确认带有部分细胞或组织由ES细胞发育而来的小鼠称为嵌合鼠(Chimeras)。嵌合鼠的部分细胞或组织是由供体胚胎发育而成,其余的细胞或组织则是由ES细胞发育而成。当嵌合鼠的生殖细胞由ES细胞发育而来时,就具有Germline Transmission的潜力,即可以将基因打靶对基因组的修饰遗传给后代。反知,如果嵌合鼠的生殖细胞完全由供体胚胎发育而来,则不能将基因打靶对基因组的修饰遗传给后代。为了得到可以遗传的基因打靶小鼠,需要将嵌合鼠与野生型小鼠回交,得到的后代称为F1代杂合子。F1代杂合子经过鉴定具有稳定遗传的特点,可以随即和其他的品系交配,如Cre工具鼠等。

    采用Cas9技术制作的Founder鼠,与上述回交繁育的目的一样, 是为了获得可以稳定遗传的F1代,但由于Cas9系统可以在受精卵阶段对基因进行编辑,基因型不是唯一的,所以需要与背景鼠回交一代以确定目标的基因型可以遗传。

    就Cas9和ES打靶技术制作的F0模型的“嵌合率”来看,Cas9制作的F0的嵌合率更高。


    对于普通的转基因,表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子,CAG、CMV等将得到全身表达的转基因小鼠;如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子,将得到组织特异性表达的转基因小鼠,如在AP2的promoter启动下进行表达,会得到脂肪组织特异表达的转基因小鼠。需要特别说明的是,转基因的策略是将转基因片段直接注射到小鼠的受精卵中,转基因片段将会在小鼠基因组中进行随机插入,因为是完全随机的,有可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达,也有可能插入到一些增强区导致转入的基因高表达。一般情况下我们在设计载体时会加入绝缘子等原件,以尽量避免内源因素对于转入基因的影响。通过原核注射的方法得到的第一代转基因小鼠称为 founder(首建鼠),由于上述随机性,每一只founder都是不一样的,以每一只founder起源的品系称为line,不同的line 之间的表达可能会有差异。首建鼠与首建鼠之间不应该相互交配。

    Cre重组酶识别loxP位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体,然后此二聚体与另一个loxP位点上的二聚体结合形成一个四聚体。LoxP位点是有方向性的,四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。然后两个loxP位点间的DNA序列被Cre重组酶切断。接着,DNA连接酶快速高效地将这些链连接起来。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。

    主要会发生以下三种情况:

    1.如果两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同,Cre重组酶介导loxP间的序列切除;

    2.如果两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反,Cre重组酶介导loxP间的序列反转;

    3.如果两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre重组酶介导两条DNA链发生交换或染色体易位。

    Cre-loxP重组酶系统的优点:

    时空特异性:除了实现目的基因在特定组织(比如利用组织特异性表达启动子+Cre)中的改造外,还可以实现目的基因在特定时间(比如在Cre后加ERT2)的改造。

    高效性:《基因打靶技术》一书中阐述过两个loxP之间的距离在1.5-3.5kb之间时,敲除效率可达99%,目前很多研究甚至可以敲除更长片段。

    应用范围广:真核及原核均适用,不同组织、不同生理条件性均可起作用。

    一般使用的时间上调控的方式一般有两种:

    Tet-On/Tet-Off(四环素诱导),Tet系统的诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox)。Tet作为一种抗生素已被应用了很长时间,且低剂量的Tet就可调节基因的表达,不会对动物或细胞产生强毒性。当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭,之后仍可通过加入诱导剂重新开启,因此该诱导系统是一种可逆系统。诱导药物如Dox等可穿越胎盘屏障,也存在乳汁中。

    作用原理图如下:

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    ERT(tamoxifen诱导),简介如下(只需要把Cre换成您需要的目的基因即可):

    基于Cre/loxP系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统,该系统将雌激素受体(estrogen receptor,ER)的配体结合区(ligand—binding domain,LBD)和Cre重组酶进行融合,产生一种嵌合重组酶,该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下,从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性,因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。为了消除内源性雌激素的影响,研究者将雌激素配体结合区进行了关键氨基酸的突变,从而使其不能与体内的生理性雌激素结合,而只能与外源性的雌激素类似物他莫昔芬结合,这样就消除了内源性雌激素所造成的非特异性基因敲除。该系统与四环素诱导系统相似,也可以对靶基因的敲除进行时间和空间二维调控。利用该系统,Schwenk等在1998年成功建立了B淋巴细胞特异启动子调控的E/1/SV40—CreERT转基因小鼠,并成功实现了他莫昔芬的诱导,结果显示在B淋巴细胞中Cre介导的重组效率达到了80%。

    上述两种诱导系统的给药方式有腹腔注射或饲喂等,给药的浓度以及周期需要测试确定最终的实验浓度和周期。

    一般来说,对于转基因小鼠的命名规则示例如下:

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    我们编号一般使用的是Gpt。而对于基因打靶类的小鼠模型,常用的命名规则示例如下:

    2.png

    另外,我们常用小鼠品系的基因型标注符号所代表的意义如下:

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    制作流程不同:与Cas9打靶相比,ES打靶增加了一步ES电转操作,该步操作预计增加3个月左右的制作周期,除此之外,ES打靶需要制作打靶载体,而打靶载体的制作需要从国外订购BAC克隆,订购周期预计1个月左右。因此,ES打靶的制作周期较Cas9打靶会多出4个月左右的时间。

    Cas9打靶主要技术路线见下图:

    1.png

    ES打靶主要技术路线见下图:

    2.png

    采用ES打靶技术制作基因编辑模型时需要在基因位点引入Neomycin抗性筛选标记用于筛选中靶的ES细胞。我们使用的PGK-neomycin标记,插入进基因的intron区域内后,一方面有可能会破坏基因的剪切位点,存在潜在的Spliced variants干扰靶基因的正常剪接;一方面PGK-promoter为非常强的启动子,它的存在有可能会对突变位点造成影响,并与可能影响该基因的上下游的基因表达、调控。同时Neo存在有文献报道会对小鼠的生殖产生一定的毒性。

    对于条件性敲除的项目,如果杂合子不存在生殖方面的表型的话,我们认为可以直接与特异表达的Cre交配一并去除Neo标记和该基因,可以不需要与Flper小鼠交配去除标记。

    而我们自主开发的自删除技术无需与FPLe小鼠交配即可去除抗性标记,可以节约3个月的建模时间。


    IRES(Internal ribosome entry site), 是一种RNA元件, 它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽子结构,从而使直接从信使RNA(mRNA)中间起始翻译成为可能。用IRES连接前后两个基因的的表达时,前后两个基因一同转录,但是在翻译水平上独立翻译,因此,翻译出来的蛋白将独立行使功能,通常情况下,IRES后面的基因的表达水平会低于前面的基因。

    Linker:是一段多肽,经常用于表达融合蛋白,例如,将A蛋白和B蛋白融合表达时,为保证两个蛋白在空间结构上是独立的,通常情况下会在A蛋白和B蛋白中间添加一段linker。注意,用linker连接的两个基因会一同转录和翻译,翻译后是一个整体的蛋白。

    2A:“self cleaving”small peptide,也是一段多肽,由2A连接的两个基因时,两个基因将一同转录翻译,翻译后的蛋白将会在2A处分开,因此,由2A连接的两个基因,表达后会独立行使功能,但是2A前面的基因会带有由2A翻译的一段多肽。

    IRESP2A的比较


    IRES

    P2A

    定义

    IRES内部核糖体进入位点序列:是一段约500bp的核酸序列,这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构,从而介导核糖体与RNA结合,能独立的起始蛋白翻译。

    P2A(2A peptide)是一种可"自我剪切"的短小肽链,最初在FMDV中发现,约22个氨基酸,2A肽可在蛋白翻译时通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂。

    优点

    IRES被放置于两个ORF之间的时候,可以同时表达这两个ORF。由于两个ORF分别有自己的起始密码子和终止密码子,所以会翻译两个独立的、没有经过修饰的蛋白。

    两个基因(ORF)通过2A多肽链连接成为一个ORFmRNA翻译成一个融合蛋白,但这两个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白。这两个蛋白的摩尔比理论上是1:1

    缺点

    IRES的存在有时候会影响mRNA的结构,同时由于IRESmRNA5CAP对核糖体/或翻译起始复合物的结合力不同,IRES后面的ORF翻译蛋白的水平有可能与IRES前面的ORF蛋白水平不一致。有的时候前面的ORF表达很好,但后面的ORF表达水平不高;有的时候后面的ORF/IRES会影响前面ORF的表达,甚至前面的ORF根本不表达。

    2A是一个大约22个氨基酸的多肽。蛋白酶切割会发生在2A多肽C端的甘氨酸(G)和脯氨酸(P)之间。所以,前一个蛋白的尾巴上会留下一个20多个氨基酸的多肽。后面一个蛋白的N端会留下一个多余的脯氨酸。尤其是第一个蛋白,如果是一个小分子(比如分泌型的细胞因子),可能其功能会受到这20多个氨基酸的影响。

    建议

    IRES序列后基因的表达效率显著低于IRES序列前基因的表达,所以与IRES相比,2A肽具有以下优点:(12A序列短,能够有效地实现连接基因之间的共表达;(2)位于2A下游的基因同样可以获得很高的表达水平。

    TG是用显微注射法将线性化的外源DNA片段直接注入小鼠受精卵的原核中,使外源基因整合到小鼠基因组中,从而获得转基因小鼠。该模型的制作过程较为简单,周期短,3个月左右即可获得founder鼠,可进行大片段的插入,例如BAC转基因。缺点是,基因在染色体中随机整合,整合位点可能会影响外源基因的表达水平,而外源基因的整合也会造成内源基因的表达异常或不表达,整合的外源基因通常情况下多拷贝,获得的founder小鼠需要建系来筛选外源基因高表达的line,并且至少需要2个表达的line来相互印证表型。

    H11/Rosa26位点定点表达,可以通过Cas9或ES打靶技术实现,依赖同源重组的原理,将外源片段定点整合到H11/Rosa26位点,在H11/Rosa26位点实现高效且稳定的表达。与TG模型相比,基因的整合位点清楚,拷贝数唯一,后续不需要建系筛选,后代小鼠基因型明确,小鼠的遗传稳定性非常高。

    二者的区别见下表:

    转基因

    H11/Rosa26位点插入

    周期(最快8周获得F0代)

    技术难度低

    可获得不同表达量的模型

    随机插入(位点、拷贝数)

    不能保证过表达

    易破坏其他内源性基因

    遗传稳定性差(多点插入)

    后期大量建系和筛选工作

    周期(最快16周获得F1代)

    技术难度高

    获得的模型唯一

    按设计精确插入

    保证过表达

    不影响其他内源性基因

    遗传稳定性高

    无需筛选,直接用于分析


    国际敲除联盟(International Knock-out Mouse Consortium IKMC),旨在将2万个小鼠基因逐一敲除。国际小鼠表型分析联盟(International Mouse Phenotyping Consortium IMPC)是基于IKMC计划制作出的基因敲除小鼠建立的一个国际性组织,目的在于高通量的分析这些小鼠的表型数据,进而阐述每个基因在基因组中的具体职能。

    中国、韩国、中国台湾和日本等国家与地区的数家研究机构共同建立了亚洲小鼠表性分析联盟(Asian Mouse Phenotyping Consortium AMPC),AMPC也将和IMPC一起共同致力于小鼠表型分析的发展。我们作为中国唯一的IMPC成员,以及AMPC发起者之一,能为您提供一个高质量的小鼠表型分析服务平台,我们将用国际标准操作流程把模型小鼠拆分成为您所需要的实验数据。